Studies on the effect of post-translational modification on learning and memory using transgenic mice of Lsd1 and Neurl 1/2

Abstract

학습과 기억은 수많은 분자적 기전들을 통해 조절된다. 그동안 많은 연구들을 통해 단백질의 번역 후 변형(Post-translational modification)이 학습과 기억에 중요한 역할을 한다는 점이 알려졌지만 여전히 밝혀내야 할 부분이 많이 남아있다. 나는 이 연구에서 여러 종류의 번역 후 변형 메커니즘 중에서 특히 단백질의 인산화 (Phosphorylation)와 유비퀴틴화 (Ubiquitination)가 학습과 기억에 미치는 영향에 대해서 연구하고자 하였다. 이를 위해 형질전환 생쥐 모델을 이용하는 일련의 실험을 진행하였으며 이 두 종류의 번역 후 변형 메커니즘이 학습과 기억에 관여한다는 생물학적 증거를 제시하였다. 첫 번째 연구에서 나는 단백질 인산화효소Cα (PKCα)로 매개되는 Lysine-specific demethylase 1 (Lsd1) 단백질의 인산화가 해마 의존적 학습과 기억에 미치는 영향을 알아보기 위해서 단백질 인산화효소Cα로 매개되는 인산화가 결핍된 Lsd1 유전자를 삽입한 생쥐 (Lsd1 KI 생쥐)를 이용하였다. 행동 실험을 진행한 결과 Lsd1 KI 생쥐는 대조군 (WT littermate)에 비해서 해마 의존적 공포 기억과 공간 기억이 저해된 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 전기생리학 실험을 통해서 Lsd1 KI 생쥐의 시냅스전 말단의 기능이 향상되어 있는 것을 관찰 할 수 있었는데, 이는 단기 시냅스 가소성 (Short-term synaptic plasticity)과 관련이 있다. 한편, 장기강화 (Long-term potentiation: LTP)와 장기억압 (Long-term depression: LTD)과 같은 장기 시냅스 가소성 (Long-term synaptic plasticity)은 Lsd1 KI 생쥐에게서 정상적으로 보존되어 있는 것이 관찰되였다. 뿐만 아니라, Lsd1 KI 생쥐의 해마 조직에 대해 RNA-seq 분석을 진행한 결과에서도 시냅스 전 말단의 기능과 관련된 유전자 발현량의 증가를 확인할 수 있었다. 본 연구는 위 결과들로부터 단백질 인산화효소Cα (PKCα)로 매개되는 Lsd1 단백질 인산화가 생리적, 분자적 수준에서 시냅스전 말단의 기능을 조절하며 학습과 기억에 영향을 미친다는 해석을 이끌어내었다. 두 번째 연구에서 나는 E3 유비퀴틴 연결효소 (E3 ubiquition ligase)인 Neurl 1 과 Neurl 2가 해마 의존적 학습과 기억에 미치는 영향에 대해서 알아보았다. 이를 위해서 Neurl 1 유전자가 결손된 Neurl 1 녹아웃 생쥐 (Neurl 1 KO 생쥐)와 Neurl 2 유전자가 결손된 Neurl 2 녹아웃 생쥐 (Neurl 2 KO 생쥐), 그리고 Neurl 1과 Neurl 2 유전자가 모두 결손된 Neurl 1, 2 녹아웃 생쥐 (Neurl 1,2 KO 생쥐)를 이용하였다. 행동 실험을 진행한 결과, 대조군 생쥐에 비해서 Neurl 1,2 KO 생쥐에서만 해마 의존적 공간 기억이 저해된 점을 확인하였다. 또한, 전기생리학 실험을 통해서 Neurl 1 KO 생쥐, Neurl 2 KO 생쥐, Neurl 1,2 KO 생쥐 모두 시냅스 기저 특성 (Basal synaptic property) 및 초기 장기강화 (Earl-phase LTP)에는 변화가 없었던 반면 Neurl 1,2 KO 생쥐에서만 단백질 합성 의존적 장기 강화 (Protein synthesis-dependent LTP)가 저해되어 있는 사실을 확인할 수 있었다. 마지막으로 Neurl 1 과 Neurl 2이 서로에 대해서 상보적인 역할을 수행할 가능성을 시험해 보기 위해서 Quantitive-real time PCR 실험을 진행하였으며, Neurl 1 KO 생쥐에서는 Neurl 2 의 전사물의, 그리고 Neurl 2 KO 생쥐에서는 Neurl 1 의 전사물의 양이 증가해 있지 않다는 결과를 얻었다. 이러한 결과들을 종합해 보면, Neurl 1 혹은 Neurl 2 중 적어도 하나의 유전자가 있는 상황에서 해마 의존적 공간 기억과 단백질 합성 의존적 장기 강화는 손상되지 않고 유지되지만, Neurl 1 과 Neurl 2 전사물의 양을 비교해 보았을 때 이 두 가지 유전자가 그 과정에서 서로 상보적인 역할을 하지는 않는다는 결론을 내릴 수 있다. 요약하자면 나는 번역 후 변형에 관련된 두 가지 연구로서, 각각 단백질 인산화효소Cα (PKCα)로 매개되는 Lsd1 단백질의 인산화와 E3 유비퀴틴 연결 효소인 Neurl 1 과 Neurl 2 가 해마 의존적 학습과 기억을 조절한다는 것을 밝혀냈다. 한편, 이 두 연구는 서로 다른 생리학적 특성과 분자적 기전을 통해서 해마 의존적 기억이 조절된다는 것을 보여주었다는 점에서 번역 후 변형이 다양한 분자적 기전을 통해 학습과 기억을 조절할 수 있다는 견해를 지지한다.

Numerous molecular signaling pathways are engaged in the regulation of learning and memory. A growing number of reports provide that post-translational modification is important for learning and memory. Nonetheless, there is still a lot to be discovered. In this thesis, among the various post-translational modification mechanisms, I focused on the role of phosphorylation and ubiquitination in the regulation of learning and memory. To do this, I used two strains of transgenic mice. The first strain of mice was PKCα-mediated phosphorylation-defective Lysine-specific demethylase 1 (Lsd1) knock-in mice. The second strain of mice consisted of three types of transgenic mice wherein Neurl 1 gene (Neurl 1 KO) or Neurl 2 gene (Neurl 2 KO) was knocked-out, or Neurl 1 and Neurl 2 gene were both knocked-out (Neurl 1,2 KO). In the first part of the current study, I have identified the function of the phosphorylation of Lsd1, mediated by PKCα, in learning and memory. Lsd1 KI mice showed impaired hippocampus-dependent fear and spatial memory. In addition, Lsd1 KI mice showed altered presynaptic function and short-term synaptic plasticity; however, long-term synaptic plasticity, such as long- term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD), was intact. Consistent with this, RNA-seq analysis of the hippocampus of Lsd1 KI mice provided that the gene expressions related to presynaptic function-related genes were altered. These results suggest that PKCα-mediated phosphorylation of Lsd1 is involved in the regulation of short-term synaptic plasticity and hippocampus-dependent memory. In the second part of the study, I have elucidated the specific functions of Neurl 1 and Neurl 2, which are both E3 ubiquitin ligase enzymes in hippocampus-dependent learning and memory. In sum, the results showed that hippocampus-dependent spatial learning and memory were impaired only in Neurl 1,2 KO mice. In addition, protein synthesis-dependent LTP was impaired only in Neurl 1,2 KO mice, nonetheless basal synaptic properties have not been altered. Moreover, I revealed that there was neither compensatory overexpression of Neurl 1 transcripts in Neurl 2 KO mice nor that of Neurl 2 transcripts in Neurl 1 KO mice. Therefore, these findings suggest that hippocampus-dependent spatial memory and protein-synthesis dependent LTP were impaired when Neurl 1 and Neurl 2 are both absent, but not when either Neurl 1 or Neurl 2 is present. Taken together, I have identified two cases in which post-translational modification is involved in the regulation of learning and memory, one concerning the effect of PKCα mediated-phosphorylation of Lsd1, and the other about the role of E3 ubiquitin ligases, Neurl 1 and Neurl 2. Even though it is hard to say that Lsd1 and Neurl 1 and Neurl 2 gene, per se, share the same molecular pathway in regulating learning and memory, these studies suggest that the phosphorylation of Lsd1 and the expression of either neurl 1 or neurl 2 is essential, in regulating hippocampus-dependent spatial learning and memory. Thus, this thesis provides multiple pieces of evidence for the fact that post-translational modification provides multiple conduits through which regulation of learning and memory could be achieved.