Genomic analysis and One-Health approach to antimicrobial resistance in Staphylococcus pseudintermedius isolates from canine pyoderma

Abstract

Staphylococcus pseudintermedius는 개의 정상 피부 미생물 총을 구성하며 개에서 발생하는 대부분의 세균성 감염에서 원인체로 작용한다. 소동물 수의임상에서 다양한 계열의 항생제가 Staphylococcus pseudintermedius감염을 치료하기 위하여 사용되고 있으며 이와 더불어 빠르게 확산되고 있는 항생제내성이 큰 수의학적 문제로 대두되고 있다. 따라서 본 연구에서는 국내 개에서 분리한 메치실린 내성 Staphylococcus pseudintermedius (MRSP) 균주의 유전형과 다제내성 Staphylococcus pseudintermedius의 pRE25-like element를 분석하고 농피증에 이환된 개와 그 보호자 사이에서 분리한 메치실린 내성 포도상구균의 유전학적 연관성을 평가하였다. 제1 장에서는 국내 개의 농피증과 외이염에서 분리한 MRSP 60주의 유전형 분포에 대한 분석을 다좌위 서열 형별분석 (MLST), direct repeat unit (dru) typing 그리고 Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing 을 통해 실시하였다. 주요 dru type은 dt11a와 dt11y 이었으며 MLST를 통해 CC365와 CC677 두 개의 clonal complex가 존재하고 있음을 밝혀내었다. 이러한 유전형 분포는 유럽과 북미, 다른 아시아 국가에서 보고되는 양상과 달랐으며 우세한 SCCmec type은 type V로 전체 중 45%를 차지하였다. 제 2장에서는 pRE25-like elements와 관련하여 발생하는 다제내성 Staphylococcus pseudintermedius (MDRSP) 에 대한 연구를 실시하였다. 총 46개의 MDRSP 균주가 개의 농피증 병변에서 분리되었으며 균주의 유전학적 특성을 밝히기 위하여 MLST, pRE25-like elements에 대한 PCR그리고 전장유전체분석 (WGS)을 실시하였다. WGS 를 통해 5개의 다른 항생제 내성유전자 (cat, erm(B), aphA3, aadK, and sat4) 와 IS1252, IS256, 그리고 IS1216로 구성되는 이동성 유전인자의 집합인 chromosomal 22-kb pRE25-like elements가 포도상구균류에서 최초로 발견되었다. pRE25-like elements염기서열의 84%는BLASTN 데이터베이스를 통한 유전체 비교 분석상 장구균의 pRE25 플라스미드 DNA 와 99.8%의 동질성을 보였으며 이는 반코마이신내성이 장구균에서 포도상구균으로 전달된 것과 같이 항생제 다제내성의 발생 또한 장구균과 포도상구균이 밀접한 유전학적 관련성을 지니고 있을 가능성을 시사한다. pRE25-like elements의 이동성 유전인자중 포도상구균류에서는 매우 드물지만, 장구균에서는 흔하게 발견되는 recombinase와 insertion sequence를 타겟으로 하는 3종의 PCR을 실시하였고 전체 균주 중 52%에 해당하는 균주가 3종의 PCR 모두에 양성반응을 보임으로써 pRE25-like elements를 보유하고 있을 가능성이 높은 균주로 확인되었다. 이 균주들에 대한 MLST를 실시한 결과 전체 18종의 Sequence type (ST) 이 존재하였으며 그중 13종의 ST가 한국에서 발견 및 보고되었던 ST로 확인되었다. 제 3장에서는 농피증에 이환된 개와 보호자에서 분리한 포도상구균 사이의 메치실린 내성에 대한 유전학적 연관성에 대한 연구를 진행하였다. 총 101주의 포도상구균이 31쌍의 개와 보호자의 비강, 손가락 피부에서 분리되었다. 메치실린 내성을 유도하는 mecA유전자가 탑재되어 있는 이동성 유전인자인 SCCmec 유형에 대한 1차 스크리닝으로 dru typing 및 PCR을 통한 SCCmec typing을 모든 균주에 실시하였고 S. pseudintermedius와 S. epidermidis는 유전형 분석을 위한 MLST를 실시하였다. SCCmec 유형에 대한 유전학적 연관성이 높을 것으로 추정되는 후보 균주에 대해서는 WGS를 통해 최종적인 SCCmec 의 비교분석을 실시하였다. 개의 농피증 병변에서 분리한 S. pseudintermedius 및 S. schleiferi 와 보호자의 손가락 피부에서 분리한 S. epidermidis 로 구성되는 1쌍에서 동일한 dru type 11a 및 SCCmec type V 를 가지는 것을 확인하여 해당 균주에 대해 WGS를 실시하였다. WGS결과 상 SCCmec 구성에 핵심적인 mec complex와 ccrC 유전자가 분포하는 지역의 염기서열이 높은 동질성 (평균 96.8%)을 가지고 있고 mec complex와 ccrC의 SCCmec지역내 위치와 분포가 일치하며 SCCmec의 시작지점인 insertion site로써 작용하는 orfX의 direct repeats (DRs) 가 본 연구에서 확인된 DR-1으로 3개 균주가 일치하는 결과를 얻을 수 있었다. 결론적으로, 국내 MRSP가 높은 유병률 (41.9%, 60/143)과 해외 다른 국가와 비교하여 독립적인 유전형 분포를 가지고 있는 것, 그리고 pRE25-like elements에 의한 다제내성 S. pseudintermedius 가 넓게 분포하고 있는 것으로 추정되며 이러한 균주의 ST 분포가 국내에서 발견되어 보고되었던 ST가 다수를 차지하고 있어 외래유입이 아닌 국내발생 균주일 가능성이 높은 점을 종합하면 국내 소동물 수의임상에서 Antimicrobial Stewardship 이 적절하게 작동하지 못하고 있으며 장기적인 국가행동계획 (National Action Plan) 이 시급한 상태임을 시사하고 있다. 또한 개와 그 보호자에서 분리한 메치실린 내성 S. pseudintermedius, S. schleiferi 및 S. epidermidis의 SCCmec 이 높은 유전학적 동질성을 가지는 것은 메치실린 내성의 발생 및 전파에 있어 개와 보호자 사이에서 단순히 병원체 자체의 이동뿐만 아니라 포도상구균류 간의 유전학적 상호작용 또한 존재할 가능성이 높다고 볼 수 있다. 따라서 원헬스적 개념에 따른 인의와 수의분야의 공조가 메치실린 내성 포도상구균류의 확산에 대한 성공적인 임상적 대응에 필수적일 것으로 사료된다.

Staphylococcus pseudintermedius is a member of the normal skin microbiota of dogs; however, as an opportunistic pathogen, it is also the cause of the majority of canine bacterial infections. Many classes of antimicrobial drugs are commonly used in small animal practice for the treatment of S. pseudintermedius infection, leading to the massive problem of rapidly emerging antimicrobial resistance. In particular, methicillin-resistant S. pseudintermedius (MRSP) poses a challenge for veterinary medicine. Therefore, the aim of this thesis was to investigate clonal distribution of MRSP isolated from dogs in Korea, the emergence of multidrug-resistant S. pseudintermedius (MDRSP) related with pRE25-like elements, and to uncover genetic relationship of methicillin resistance between staphylococci isolated from dogs affected with pyoderma and their owners. In chapter 1, the clonal distribution of MRSP isolates from dogs affected with pyoderma and otitis externa in Korea was determined. Sixty MRSP isolates were obtained from the lesions of dogs with canine pyoderma and otitis externa. Their genetic diversity was assessed by multilocus sequence typing (MLST), direct repeat unit (dru) typing, and staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) typing. The major dru types were dt11a and dt11y. Two clonal complexes (CCs), CC568 and CC677, were revealed by MLST; this result differed from the dominant STs detected in MRSP isolates from Europe, North America, and other Asian countries. SCCmec type V was the major type (27/60, 45%). In chapter 2, the emergence of multi-drug resistant S. pseudintermedius (MDRSP) carrying pRE25-like elements was analyzed. In total, 46 MDRSP strains were isolated from clinical cases of canine pyoderma. Their genetic characteristics were revealed by MLST, polymerase chain reaction (PCR) targeting of pRE25-like elements, and whole-genome sequencing (WGS). WGS detected that the chromosomal 22-kb pRE25-like elements contained five antimicrobial-resistant genes (cat, erm(B), aphA3, aadK, and sat4), IS1252, IS256, and a toxin-antitoxin (TA) system within copies of IS1216. BLASTN alignment revealed that 84% of the chromosomal 22-kb pRE25-like elements sequence is homologous (99.8% identity) to the enterococcal pRE25 plasmid sequence. PCR showed that 52% of the MDRSP isolates were positive for pRE25-like elements and were thus presumed to contain pRE25-like elements (pRE25 group). The STs of the pRE25 group were diverse, with 18 STs identified, including 12 STs first reported in Korea. In chapter 3, the genetic relationship of methicillin resistance between staphylococci isolated from dogs affected with pyoderma and skin of dog owners was investigated by WGS. A total of 101 Staphylococcus strains were isolated from 31 dog-owner pairs. The clonal lineage was characterized by MLST. Genetic relatedness of the isolates from dogs and owners was first evaluated with dru and SCCmec typing, and WGS confirmed the similarity of DNA sequences and the structural composition of SCCmec. In one pair, S. pseudintermedius (dog), S. schleiferi (dog), and S. epidermidis (dog owner) isolated from a dog affected with pyoderma and the dog owner showed remarkable genetic similarity in SCCmec with respect to DNA sequences, dru type, structure composition of ccrC and the mec complex, and DR-1 in orfX, which is considered to be the insertion site of SCCmec. In conclusion, a relatively high prevalence (41.9%, 60/143) and independent clonal characteristics compared with other countries highlight the rapid emergence of MRSP isolated from dogs in Korea. Moreover, MDRSP induced by pRE25-like elements is suspected to be widespread, and the MLST results indicated Korea as the potential geographical origin of the MDRSP lineage carrying pRE25-like elements. These results suggest that veterinary antimicrobial stewardship has not been applied consistently in the field of small animal practice in Korea, thus calling for a long-term national action plan. The risk of SCCmec transfer between dogs and their owners was estimated by WGS, demonstrating remarkable genetic similarity of SCCmec among S. pseudintermedius (dog), S. schleiferi (dog), and S. epidermidis (dog owner) in one of the pairs. Therefore, a strategy countering the spread of methicillin-resistant staphylococci should be based on the cooperation of veterinary medicine and human medicine under the One-Health concept.