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New Platform for Gene Therapy using In Vivo Knock In into Safe Harbor Locus
안전항구 위치에 생체 내 넉인을 이용한 새로운 유전자치료 플렛폼

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Authors
안세준
Advisor
염수청
Issue Date
2020
Publisher
서울대학교 대학원
Keywords
Adeno-associated virusCRISPR/cas9Genetic disorderin vivo genome editingsafe harbor gene
Description
학위논문 (석사) -- 서울대학교 대학원 : 국제농업기술대학원 국제농업기술학과, 2020. 8. 염수청.
Abstract
As part of efforts to treat the genetic disorder, there have been many
advances in the field of in vivo genome editing. However, the low editing
efficiency due to technical problems acts as a limitation directly repairing the
mutant gene. Thus, I tried to develop a novel gene-editing strategy for curing
genetic disorders using knock-in (KI) into safe harbor locus, which exhibited
high expression in the liver. Based on the microarray experiment using
human hepatocyte, the Apoc3 gene was selected as the locus for KI. A
portion of the human Apoc3 gene, which was harboring highly efficient
sgRNA binding site of spCas9 and cjCas9, was used to generate genetically
human-mimicking animals. B6.Apoc3-hApoc3 KI mice exhibited high gene
expression in the liver (300 folds more elevated than the F9 gene) and no
alternative splicing. Besides, hemophilia B was selected as a genetic disease
to be treated using in vivo gene editing. The hemophilia B model mouse is
generated through the deletion of the coagulation factor 9 gene using
CRISPR/Cas9 and had a phenotype of clotting disorder similar to hemophilia
B patients. After mouse production, three strategies for in vivo therapeutic
gene KI into Apoc3 were applied using adeno-associated virus packing
CRISPR/cas9 and donor template. First, the homologous recombination
strategy was founded to be a failure due to donor auto-expression and
extremely low KI efficiency. However, NHEJ mediated KI (HITI or AAV
mediated integration) presented human F9 concentration (about 50, 250ng/ml
at six weeks after injection) without donor's auto-expression. In conclusion,
the model mice for in vivo genome editings such as mApoc3-hApoc3 KI and
F9 KO were produced. In the attempts of in vivo genome editing, some
indicators presenting the low KI efficiency were found through PCR and
ELISA. To increase KI efficiency, a high dose experiment is on-going.
유전장애를 치료하는 노력의 일환으로 많은 증상을 환화하기
위한 방법들이 있으나, 주기적인 투여로 인해 환자의 불편 및
경제적 부담을 유발합니다. 이러한 문제점을 해결하기 위한, 생체
내 게놈 편집 분야의 많은 발전에도 불구하고, 여전히 편집 효율이
매우 낮아서 돌연변이 유전자를 직접적으로 수리하는 것에
어려움을 겪고 있습니다.
따라서, 앞선 한계점을 해결하기 위해서 간에서 높은 발현량을
나타내는 안전 항만 좌위로 치료유전자를 녹인하는 전략을
사용하여, 유전장애를 치료하기 위한 새로운 유전자 편집 전략을
개발하려고 노력하였습니다.
인간 간세포를 사용한 마이크로 어레이 실험의 결과를 토대로,
매우 높은 발현량을 가진 Apoc3 유전자가 치료 유전자를 삽입하기
위한 장소로 선택하였습니다. 그러나, 이러한 정보들은 사람에서
유래된 것이기 때문에 바로 동물실험에 적용하기에 적합하지
않았습니다. 사람의 Apoc3 유전자 내에서도, spCas9 및 cjCas9을
위한 높은 효율의 sgRNA 결합 부위를 함유하는 염기서열을 마우스
게놈내로 삽입하여, 유전적으로 인간-모방 마우스를
생산하였습니다. 생산된 B6.Apoc3-hApoc3 KI 마우스 간에서
Apoc3가 질병원인 유전자들보다 40-300배 높은 것을 알 수 있었고,
인간 염기서열의 넉인은 Apoc3의 대안적인 스플라이싱을
유발시키지 않았습니다.
이러한 B6.Apoc3-hApoc3 KI 마우스를 이용하여, 생체 내 편집
기술을 통해 치료할 유전질환은 혈우병 B입니다. 혈우병 B
마우스는 CRISPR/Cas9을 사용하여 응고인자 9 유전자의 결실을
통해 생산되었으며, 혈우병 환자와 비슷한 표현형을
나타내었습니다.
2가지의 모델 마우스의 생산 이후에, CRISPR 및 공여자 주형을
표적세포에 도입시키기 위해서 아데노 관련 바이러스를 치료
유전자의 넉인 전략에 사용하였습니다. 3가지의 전략중에 첫번째
시도에서, 동종 재조합 전략은 매우 낮은 넉인 효율과 공여자
주형에서 발견된 자동발현 문제로 인해 넉인의 증거를 확인할 수
없었습니다. 그러나, 2가지 비동종 말단 연력을 이용한 전략에서는
공여자 주형에서 자동-발현이 없는 발견되지 않았고, 약간의
긍정적인 결과를 얻을 수 있었습니다. 그러나 이 또한 낮은
발현양상을 나타낸다는 문제점을 가지고 있었습니다.
결론적으로 B6.Apoc3-hApoc3 KI 및 B6.F9 KO과 같은 생체 내
게놈 편집을 위한 모델 마우스의 생산에 성공하였고, 생체 내 게놈
편집을 시도하고 있습니다. 현재까지의 데이터에 따르면 낮은
효율로 인해 뚜렷한 넉인의 증거들을 얻지 못하였습니다. 이러한
넉인 효율을 높이기 위해 고용량 실험을 진행중에 있습니다.
Language
eng
URI
http://hdl.handle.net/10371/169497

http://dcollection.snu.ac.kr/common/orgView/000000162543
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Appears in Collections:
Graduate School of International Agricultural Technology (국제농업기술대학원)Dept. of International Agricultural Technology (국제농업기술학과)Theses (Master's Degree_국제농업기술학과)
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