Antifungal characterization of cathepsin L propeptide-like cysteine protease inhibitor against food spoilage yeasts

Abstract

Recently, as risks have emerged related to the use of chemical antifungal food preservatives, the food industry has demonstrated a need for a novel antifungal agent. Several plant-derived peptides that inhibit proteases and fungal growth have been reported, but their antifungal properties have not been fully characterized. This study investigated the antifungal activity of SnuCalCpI15, a novel, cysteine protease propeptide from the tropical plant Calotropis procera R. Br.; this material may replace chemical preservatives that inhibit yeast growth in foods with high sugar content and low acidity. Yeast spoilage of such foods is a major problem. The effects of SnuCalCpI15 on the morphology of food spoilage yeasts were also explored. First, the inhibitory activities of the propeptide were evaluated with respect to three cysteine proteases and two serine proteases. SnuCalCpI15 specifically inhibited only papain-like cysteine proteases, including papain itself. The IC50 values were 32.19±23.90 nM, 8.42±1.74 μM, and 48.07±8.17 μM against 0.05 nM cathepsin L, 1.41 μM papain, and 1.60 μM bromelain, respectively. In contrast, SnuCalCpI15 did not inhibit serine proteases from bovine pancreas. The antifungal activities of SnuCalCpI15 against four food spoilage yeasts (Candida albicans, Pichia anomala, Saccharomyces cerevisiae, and Rhodotorula mucilaginosa) were evaluated using the broth micro-dilution method and a time-kill assay. SnuCalCpI15 exhibited concentration-dependent growth inhibition of all four yeast strains. For C. albicans and S. cerevisiae, the MICs were 3,000±90.47 and 3,000±65.28 ppm, respectively. The MICs for P. anomala and R. mucilaginosa were 4,000±120.45 and 4,000±87.05 ppm, respectively. FITC-labeling of SnuCalCpI15 revealed that the propeptide initially bound to yeast cell surfaces, then entered the cells. Changes in cell membrane permeability were visualized using the Live/Dead cell viability assay and propidium iodide uptake. SnuCalCpI15 altered yeast cell membrane permeability. Morphological yeast cell changes were investigated via transmission electron microscopy; SnuCalCpI15 significantly enhanced cell wall thickness. These results suggest that SnuCalCpI15, a specific cathepsin L-like propeptide that inhibited papain-like cysteine proteases, is a potent alternative to chemical antifungal food preservatives to improve the shelf life and quality of foods vulnerable to yeast spoilage.

화학적 항진균제 및 식품 보존제의 인체 위험성이 주목받음에 따라 새로운 생장 저해 전략을 가진 항진균 물질의 필요성이 대두되었다. 식물은 진균에 대한 자체 방어 기제로 여러가지 펩타이드를 분비하는데, 이 중에서 프로테이스 저해제들은 여러 항진균 활성이 보고되었음에도 불구하고 아직 그 메커니즘이 정확하게 밝혀지지 않았다. 본 논문에서는 열대 약용 식물로부터 얻어져 SnuCalCpI15라고 명명된 새로운 물질인 시스테인 프로테이스 프로펩타이드가 효소 저해제로서 가지는 특이성과 항진균 활성을 조사하고, 4가지 식품 부패 유발 효모에 대한 형태 변화 효과를 관찰하였다. 효소 저해 활성의 검증 및 특이적 저해 활성 확인을 위해서 시스테인 프로테이스 3종과 세린 프로테이스 2종에 대한 저해 효과를 비교한 결과, SnuCalCpI15는 특이적으로 파파인 유사 시스테인 프로테이스만을 저해하였으며, bovine pancreas 유래 세린 프로테이스는 저해하지 못하였다. 파파인과 브로멜라인에 대한 IC50값은 각각 8.416±1.744 μM과 48.069±8.172 μM이었다. 식품 유래 효모에 대한 SnuCalCpI15의 항진균 효과를 확인하기 위하여 낮은 pH 및 고당도 식품에서 의도하지 않은 부패를 유발한다고 알려진 효모 4종 (C. albicans KCTC 7678, P. anomala KCTC 7295, S. cerevisiae KACC 30008, 및 R. mucilaginosa KCTC 7829)을 선발하였고, broth micro-dilution test와 time-kill assay를 통해 SnuCalCpI15 처리가 효모에 미치는 생장 저해 효과를 평가하였다. 그 결과, 진균 사멸 효과는 관찰되지 않았지만 농도 의존적 정균 효과가 관찰되었고, 생장 최소억제농도는 C. albicans, S. cerevisiae에 대하여 각각 3,000±90.47 ppm과 3,000±65.28 ppm, 그리고 P. anomala, R. mucilaginosa에 대해 각각 4,000±120.45 ppm과 4,000±87.05 ppm으로 결정되었다. 이러한 저해 효과의 원인을 추론하기 위해서, SnuCalCpI15에 형광물질인 FITC를 표지 한 후 효모에 처리함으로써 SnuCalCpI15의 위치를 추적한 결과 대부분의 단백질이 세포 표면에 위치해 있지만 배양 시간이 지남에 따라 점차 효모 내부로 진입한다는 것을 알 수 있었다. 이어서 SnuCalCpI15가 효모의 세포막 변화를 유발하는지 확인하기 위해, 살아있는 세포와 세포막 투과성이 변하여 사멸한 세포를 형광 염료인 SYTO 9과 PI를 이용하여 염색하였고 형광 현미경으로 관찰하여 세포막이 손상되었음을 확인하였다. 또한 PI uptake assay를 통해 세포막 투과성의 변화 정도를 정량 하였다. 마지막으로 세포의 전체적인 형태 변화 여부를 보기 위해 TEM을 이용하여 4가지 효모의 이미지를 획득한 결과, SnuCalCpI15 처리에 따라 효모 세포벽의 두께 증가, 형태 유실 및 종에 따라 세포막의 거친 정도 증가가 관찰되었다. 결과적으로, SnuCalCpI15는 세포막 투과성을 변화시켜 세포 내부로 들어가며, 내외부에 축적되어 세포벽과 세포막의 완전성에 타격을 준다는 것을 확인할 수 있었다. 세포벽의 완전성 결함은 효모 세포벽 합성을 관장하는 cell wall integrity 경로에 SnuCalCpI15가 영향을 준 것으로 예상되지만, 정확한 메커니즘 규명을 위해서는 추가 연구가 필요하다. 결론적으로, 파파인 유사 시스테인 프로테이스 저해활성을 가지는 식물 유래 프로펩타이드 SnuCalCpI15는 식품 부패 효모의 생장을 저해하므로, 효모에 의한 식품 부패를 억제하는 보존제로서의 기능을 수행할 수 있음을 시사한다.