Identification of causative agents with high mortality in marine bivalve and application of bacteriophage to prevent Vibrio coralliilyiticus infection

Abstract

This study was conducted to identify the causative agent with high mortalities in marine bivalve hatcheries in Korea and to find out the alternative method against antibiotics abuses. Since November 2017, high mortalities of larvae of bay scallop (Argopecten irradians) were reported in hatcheries located at the southern area of Republic of Korea. Over 90% of larvae aged 5 to 10 days sank to the bottom of the tank and died. The hatcheries could not produce spat and thus artificial seed production industry incurred huge losses. We identified Ostreid Herpesvirus-1 μVar (OsHV-1 μVar) associated with mass mortality by PCR, sequencing and transmission electron microscopy (TEM). All the samples were positive for OsHV-1 μVar with 99% sequence identity to previously reported OsHV-1 μVar sequences. Partial sequence of ORF-4 of OsHV-1 detected in this study was more closely related to sequences isolated from Europe. This is the first report to confirm the mortality caused by an OsHV-1 infection in the bay scallop. We first isolated and characterized a high virulent of Vibrio coralliilyticus designated as SNUTY-1 that was the cause of Pacific oyster larvae mortality in Korea. SNUTY-1 showed anti-microbial resistance to β-lactams, such as penicillins, cephalosporins, and carbapenems. We sequenced and assembled the complete genome of SNUTY-1 (5,842,676 bp), consisting of two chromosomes (Chr I and Chr II) and two plasmids (pSNUTY1 and pSNUTY2). SNUTY-1 had a unique plasmid (pSNUTY2), which could mean that the Korean isolate is different from other sequenced V. coralliilyticus strains from different geographical origins. Toxic proteins such as cytolysin/ hemolysin and extracellular metalloprotease genes were encoded on Chr I and Chr II of SNUTY-1. These data facilitate the control of V. coralliilyticus infections in aquaculture by providing valuable insights into the biodiversity of this organism and valuable information for the study of virulence factors. We isolated and characterized the phage that specifically infects V. coralliilyticus. The phage was designated pVco-14 and classified as Siphoviridae. We also investigated the potential efficacy of the isolated phage against V. coralliilyticus infection. pVco-14 was stable at wide temperature (4-37℃) and pH (5.0-9.0) ranges. When oyster larvae were pre-treated with the phage before the bacterial challenge, mortality of the phage-treated oyster larvae was lower than that of the untreated control. These results suggest that pVco-14 has potential to be used as a prophylactic agent for preventing V. coralliilyticus infection in marine bivalve hatcheries and can reduce the overuse of antibiotics. Overall, the present study offers important insight into the biodiversity of the OsHV-1 and Vibrio spp. and provides valuable information for the aquaculture. Futher studies are required to determine appropriate treatments for preventing OsHV-1 and V. coralliilyticus infection-induced mass mortality events at marine bivalve hatcheries. As invertebrates, including bivalves, do not have acquired immune systems, disease prevention methods (e.g. vaccination) are very limited compared to fish. Therefore, the application of bacteriophage may be a solution for the prevention of bacterial disease in invertebrates. The results of our study showed that phage potentially can be used as an effective substitute for antibiotics in the field of bivalve artificial seedling production while reducing the generation of antibiotic-resistant bacteria and environmental pollution.

Ostreid Herpesvirus-1 (OsHV-1)은 부유유생기부터 부착기 단계 치패의 대량 폐사를 유발하는 병원체 중 하나이다. OsHV-1의 감염으로 인한 대량 폐사는 전 세계적으로 매년 지속적으로 발생하고 있지만, 현재까지 그 치료법은 개발되지 않고있다. 2017년 11월 이후, 한국의 해만가리비 종묘 생산장에서 지속적인 대량 폐사가 발생하였다. 5-10일령의 유생이 급속하게 수조의 바닥에 가라 앉으며 90% 이상의 폐사율을 기록 하으며, 이러한 대량 폐사의 지속적인 발생으로 인해 한국의 이매패류 종묘 생산장에서는 원활한 유생의 생산이 불가능하게 되어 그 경제적 손실이 매우 크게 발생하였다. 원인 불명의 대량 폐사 원인체를 규명하기 위해 본 연구가 수행되었고, PCR, sequencing 그리고 TEM을 통한 실험 결과 OsHV-1이 원인체로 지목되었다. PCR을 통한 연구에서 폐사한 모든 유생이 OsHV-1 양성반응을 나타냈으며, TEM을 통한 유생의 조직 검경 결과에서도 viral capsid가 관찰되었다. 검출된 OsHV-1의 염기서열을 분석한 결과, 본 연구에서 분리된 OsHV-1은 OsHV-1 µVar로 분류되었다. 계통분석을 통해 기존에 보고된 OsHV-1들과의 근연성을 분석한 결과, 지리적으로 근접한 한국, 중국 그리고 일본에서 보고된 OsHV-1 µVar보다 유럽의 variants들과 더욱 근연성을 나타냈었다. 본 연구의 결과는 해만 가리비에서 OsHV-1 µVar을 분리 및 분석에 대한 최초의 보고이다. Vibrio spp.는 수생생물의 질병을 유발하는 주요 세균으로 알려져 있으며, 그 중에서도 Vibrio coralliilyticus는 산호와 이매패류 유생의 대량 폐사를 유발하는 주요 원인체로 보고되고 있다. 2000년대 중반 이후 한국의 참굴 종묘 생산장에서 지속적인 대량 폐사가 발생하였으나 원인체가 Vibrio속 세균으로 추정된다는 연구 결과만 있을 뿐, 그 원인체 분석에 대한 명확한 연구는 현재까지 진행되지 않았다. 따라서 본 연구에서는 국내 최초로 대량 폐사가 발생한 참굴의 종묘 배양장의 유생에서 V. coralliilyticus의 분리 및 동정을 수행하였다. 참굴 유생에 분리된 V. coralliilyticus의 인위감염 실험과 항생제 감수성 검사를 통해 고병원성의 항생제 다재 내성 세균임을 확인하였다. 분리된 V. coralliilyticus의 전체 유전자 염기서열 분석을 통해 2개의 chromosomes (Chr I, Chr II)과 2개의 plasmids (pSNUTY1, pSNUTY2)로 구성된 것을 확인하였다. 두 chromosome의 기능분석 결과, Chr I에 세포의 기본 기능과 관련된 유전자가 Chr II에 비해 더 많이 있는 것으로 확인되었으며, 계통수 분석 결과 본 연구에서 분리된SNUTY-1은 기존에 보고된 V. coralliilyticus strains와 매우 근연한 것으로 나타났다. SNUTY-1은 pSNUTY2라는 독특한 plasmid를 가지고 있는 것으로 확인되었는데, 이는 한국의 분리주가 다른 지리학적 기원에서 나온 V. coralliilyticus들과는 차이가 있음을 의미한다. 본 연구의 결과는 V. coralliilyticus의 생물 다양성에 대한 중요한 통찰력 및 독성인자 연구를 위한 정보를 제공함으로써 양식산업에서의 V. coralliilyticus 감염을 예방하기 위한 데이터로 활용 될 수 있을 것으로 기대된다. 항생제 다재 내성균의 출현과 함께 항생제 대체재 개발에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그 중, 박테리오파아지 (파아지)는 자연계에 존재하는 친환경 물질로 항생제의 대안으로 지목되어 활발한 연구가 진행중에 있다. 본 연구에서는 이매패류 종묘 배양장에서 참굴 유생의 대량 폐사를 유발하는 항생제 다재 내성 V. coralliilyticus의 감염을 예방하기 위한 방안으로, V. coralliilyticus에 특이적으로 감염하는 파아지의 분리, 특성 분석 그리고 참굴 유생에 직접 적용하여 그 예방효과를 검증하기 위해 실시되었다. 실험 결과, V. coralliilyticus에 감염하는 파아지 pVco-14를 분리하였으며, TEM을 통한 관찰을 통해 Siphoviridae에 속하는 것으로 확인하였다. pVco-14의 특성 분석 및 안정성 검사에서 실제 양식장의 매우 적합한 것으로 확인되었다. pVco-14의 예방 효과를 입증하기 위해 in vivo test를 실시한 결과, 파아지를 처리한 실험군에서 참굴 유생이 월등한 생존율을 나타낸 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 pVco-14가 해양 이매패류 종묘생산장에서 V. coralliilyticus 감염을 예방하기 위한 예방제로 사용될 수 있으며, 항생제의 오남용으로 인한 슈퍼박테리아의 출현 및 환경 오염을 줄일 수 있음을 시사한다.