The Role of Macrophage Ninjurin1 on Mouse Colitis

Abstract

The incidence of inflammatory bowel disease (IBD) has been increasing, and IBD has become an emerging disease that requires greater elucidation of its pathogenesis. In common, IBD leads to complications like colon cancer, which is a life-threatening problem. IBD was considered as a growing disease only in western world in the past. However, recent studies report a significance rise in the number of cases of IBD in Asian countries. Especially, there has been a twentyfold increase in the number of patients with IBD over the last fourteen years in Korea. IBD is characterized by the dysregulated immune system, which means that it is an immune-mediated disease. Immune cells in the gut including macrophages, T cells, B cells, and dendritic cells are involved in contributing IBD. These immune cells induce inflammation via secreting pro-inflammatory cytokines and chemokines. Especially, macrophages are able to regulate IBD development by changing their polarized phenotype. Nerve injury-induced protein 1 (Ninjurin1, Ninj1) is a cell-surface adhesion molecule that regulates cell migration and attachment. Several studies revealed that Ninjurin1 promoted macrophage migration capacity. However, the precise function of Ninjurin1 has not yet been clearly defined. Herein, I demonstrate that Ninjurin1 protein expression is increased in a dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis model, which is confirmed in IBD patients. To directly assess whether Ninjurin1 plays an important role in colitis, I introduced WT and Ninjurin1-deficient mice (KO) mice to 1.5% and 2.5% DSS and evaluated colitis incidence. Ninjurin1 KO mice showed significantly less body weight loss and longer colon length when compared with WT mice. I also performed hematoxylin and eosin staining of colon tissue sections, which revealed that less crypt destruction, surface epithelial erosion, and reduced submucosal edema in DSS-treated Ninjurin1 KO mice compared to DSS-treated WT mice. No such differences in colon tissue histology were shown in control mice of either genotype. Likewise, relatively intact mucosa and larger number of mucin-containing goblet cells were remained in DSS-treated Ninjurin1 KO mice compared to WT mice, which were assessed by Ki-67 and Alcian blue staining, respectively. Various immune cells infiltrate into the site of inflammation during the development of colitis. To study what type of immune cell made a difference in colitis incidence according to Ninjurin1 expression, I investigated Ninjurin1 expression pattern on lymphocytes and myeloid cells. Myeloid cells showed the highest expression of Ninjurin1 among the various immune cells. Interestingly, Ninjurin1 does not regulate migration capacity of macrophages during development of experimental colitis. Next, I examined activation of macrophages under inflammatory conditions. Cytokines and chemokines secreted by activated macrophages play critical roles at the site of inflammation. I evaluated gene and protein expression of cytokines and chemokines in the presence or absence of Ninjurin1 in macrophages. Compared to WT cells, Ninjurin1 KO macrophages expressed less amount of cytokines and chemokines. To validate that Ninjurin1 on macrophages affects the intestinal inflammation, I generated mice with a conditional deletion of Ninjurin1 in macrophages (Ninjurin1fl/fl ; Lyz2-Cre+). Myeloid specific Ninjurin1-deficient mice exhibited significantly attenuated body weight loss, shortening of colon length, intestinal inflammation, and lesser pathological lesions than WT mice. Furthermore, DSS-treated myeloid specific Ninjurin1-deficient mice expressed less amount of pro-inflammatory cytokines compared to DSS-treated WT mice. During the development of colitis, the Ninjurin1 expressing macrophages secrete more cytokines and chemokines by regulating PKCδ/θ-STAT1 activation. Colon tissues from DSS-treated WT mice expressed activated PKCδ/θ compared with those from DSS-treated Ninjurin1 KO mice. Pharmacological and genetic inhibition of PKCδ/θ-STAT1 pathway led to reduced production of pro-inflammatory cytokines in WT macrophages. In summary, I suggest that Ninjurin1 in macrophages has a pivotal function in colon inflammation.

Nerve injury-induced protein 1 (Ninjurin1)은 손상된 신경 주위 슈반세포에서의 발현이 처음으로 알려진 세포막 단백질이다. Ninjurin1은 염증반응에서 대식세포의 이동과 부착에 관여하여 염증반응을 조절한다고 알려져 있다. 또한 Ninjurin1은 대식세포, 단핵구, 그리고 호중구와 같은 혈액 유래 면역세포에서 강력하게 발현된다고 보고되었다. 현재까지 많은 연구가 대식세포에서 대해 이루어져 있지만 생리학적 현상에 대한 보고는 제한적이며 자세한 염증조절기전이 알려지지 않아 염증성 질환에서의 Ninjurin1의 작용 기전을 밝히는 연구가 필요할 것으로 생각되었다. 염증성 대장질환은 위장관의 만성 염증 상태를 나타내는 용어로서 크론병과 궤양성 장염으로 구분되며 이들 모두 염증의 발생과 완화가 반복되는 것이 특징이다. 대장염 발생 시, 여러 면역 세포들 중 선천 면역을 담당하는 대식세포의 활성화가 주된 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 Ninjurin1의 염증 조절 기전을 대장염 발생과정에서 확인하고자 하였다. 공개된 유전체 빅데이터인 Gene Expression Omnibus에서 Ninjurin1과 대장염의 상관관계를 분석한 결과 대장염 환자들의 대장 조직 샘플 내 Ninjurin1 발현 양이 정상 대장 조직에 비하여 유의적으로 증가함을 확인하였다. 또한 대장염 환자들의 림프구 및 단핵구에서 Ninjurin1의 mRNA 발현 양이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 대장염 발생 과정에서 Ninjurin1이 중요한 역할을 할 것으로 생각하였다. 본 연구에서는 대조군과 Ninjurin1 유전자 결손 마우스(Ninjurin1 KO)에 dextran sodium sulfate (DSS)를 8일 동안 처리하여 대장염을 유발하였다. Ninjurin1 KO 마우스에서는 대조군 마우스에 비해 대장염 병변이 미약하였고 대장염 유도에 따라 대식세포에서 Ninjurin1의 발현이 현저하게 증가하는 것이 관찰되었다. 대장염 부위의 대식세포 수를 분석한 결과 Ninjurin1의 발현은 대식세포의 이동성에는 관여를 하지 않는다는 것을 확인하였다. Microarray를 수행하여 대식세포에서 Ninjurin1이 결손 됨에 따라 대부분의 염증 관련 유전자의 발현이 현저하게 저하되었음을 확인하였다. LPS에 의한 마우스 대식세포주의 염증 활성화 과정에서 Ninjurin1 유전자의 발현을 억제하면 염증성 사이토카인 유전자가 대조군에 비해 적게 증가하였다. 또한 대조군 마우스 대장조직에 비해 Ninjurin1 KO 마우스 대장조직에서 사이토카인 발현이 낮았다. 대장염 발생에서 대식세포의 Ninjurin1이 중요한 역할을 하고 있음을 확인하기 위하여 대식세포 특이적으로 Ninjurin1의 발현을 억제한 마우스에 대장염을 유발하였다. Ninjurin1이 대식세포에서 결손 됨에 따라 대조군에 비해 더 미약한 병변이 관찰되었고, 대장 조직으로부터 분비된 사이토카인을 측정한 실험에서도 대조군에 비해 사이토카인의 분비가 감소되어 있음을 확인하였다. 대식세포에서 Ninjurin1이 염증 신호를 전달하는 기전을 확인한 결과, 대조군에 비해 Ninjurin1 KO 마우스의 대장 조직에서 Protein Kinase C (PKC) δ/θ의 활성화가 감소되어 있음을 관찰하였다. 마우스 유래 대식세포주에서 LPS를 처리한 실험에도 일관된 결과를 얻었다. 본 실험에서는 위 일련의 실험들을 통하여 다음과 같은 몇 가지 현상 및 기전을 밝혔다. (1) 대장염 유도시 대조군 마우스에 비해 Ninjurin1 KO 마우스에서 대장염 병변이 미약하게 관찰되었다. (2) Ninjurin1이 대식세포 특이적으로 억제된 마우스에서도 대조군 마우스에 비해 병변이 덜 증가하였다. (3) 대식세포에서 Ninjurin1 발현의 억제는 IL1β와 같은 염증성 사이토카인의 분비를 감소시켰다. (4) Ninjurin1은 PKCδ/θ 단백질의 활성화를 조절하여 염증성 사이토카인의 분비를 유도하였다. 따라서 본 연구는 대식세포에서 Ninjurin1이 PKCδ/θ 활성화를 유도하고 염증성 사이토카인의 분비를 증가시켜 결과적으로 대장염 발생을 일으키는 작용 기전을 규명하였으며 이로 인해 대장염 유발의 원인으로서 Ninjurin1의 가능성을 제시한다.