Imaging H2S in Hypoxic Condition Using [99mTc]Tc-gluconate

Abstract

서론: 황화수소는 염증 조절, 혈관확장, 산소 감지, 혈관 신생, 저산소증 및 재관류손상과 같은 다양한 생리적 과정에서 발현된다. 따라서 H2S의 표적과 영상화는 신호전달물질의 역할을 연구하는 데 중요한 역할을 할 것이다. 현재까지 형광과 발광을 이용한 황화수소 영상화 기술은 다양하게 소개가 되었지만, 방사성 핵종을 사용하는 방법은 64Cu-cyclen이 처음이었다. 형광, 발광 probe는 독성이 있고 감도가 낮고 장기투과율이 낮아 외과적으로만 사용 가능하며 진단에 사용되기는 어려움이 있다. 따라서, 이 연구는 보다 안전한 테크네튬-99m이 표지 된 방사성의약품으로 허혈성 부위에 발현된 황화수소를 표적하기위해 연구하였다. 방법: 글루콘산을 Tc-99m 표지 물질로 사용했다. Tc-99m 표지 된 글루콘산 ([99mTc]Tc-gluconate)을 황화 수소 나트륨과 반응하여 불용성 입자 형성 확인 실험을 진행했다. 불용성 입자 생성은 얇은막 크로마토그래피 (ITLC-SG: Instant Thin Layer Chromatography)를 이용해 확인하였다. In vitro 연구를 위해 [99mTc]Tc-gluconate의 세포내 축적을 확인하기위해 대장암 세포주인 CT26가 사용되었다. 세포를 저산소 환경으로 만들기 위해 저산소 세포배양기에서 배양해 실험을 진행했다. 세포에 축적된 [99mTc]Tc-gluconate의 양은 감마카운터에 의해 측정되었다. In vivo 연구를 위해, 고무 지혈대를 이용한 허혈-재관류 마우스 모델을 제작하였다. 허혈-재관류 마우스 모델에 황화수소 표적 형광물질 (HSip-1)을 꼬리정맥 주사를통해 주입하여 황화수소의 발현을 확인하였다. 형광 신호는 IVIS Lumina II를 통해 검출하였다. 또한 허혈성 하지 모델의 뒷다리 조직으로 절단 샘플을 제작하여 면역 형광 염색을 진행했다. 이후 공초점 현미경 영상을 이용해 조직에 축적된 황화수소 표적 형광 신호를 검출 하였다. 이후 [99mTc]Tc-gluconate 가 황화수소를 영상화 하는데 사용될 수 있는지 확인하기위해 허혈-재관류 마우스 모델에 [99mTc]Tc-gluconate를 꼬리정맥 주사하여 허혈성 부위에 축적된 [99mTc]Tc-gluconate를 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영기 (SPECT/CT)를 이용하여 검출하였다. 결과: 글루콘산을 테크네튬-99m과 성공적으로 표지하였다. [99mTc]Tc-gluconate과 황화 수소 나트륨을 반응하여 불용성 입자가 형성됨을 확인 하였다. 세포 실험에서 [99mTc]Tc-gluconate가 정상세포와 비교했을 때 저산소 세포에 더 높은 섭취가 측정되었다. 허혈성 하지모델에서 형광 detection probe (HSip-1)가 정상 다리에 비해 허혈-재관류 부위에 더 많이 축적됐고 높은 형광신호가 측정 되는 것을 보였다. 이를 통해 허혈-재관류 부위에 황화수소가 발현됨을 확인할 수 있었다. 나아가 허혈성 하지 부위에 [99mTc]Tc-gluconate가 결합되어 insoluble complex를 형성하여 SPECT/CT 영상이 가능함을 확인했다. [99mTc]Tc-gluconate의 축적은 재관류시간을 3시간 준 뒤 진행했으며 흡수된 선량은 정상다리보다 높았다. 결론: 허혈-재관류 부위에 황화수소가 발현됨을 확인할 수 있었다. 방사성 표지 [99mTc]Tc-gluconate가 허혈성 부위에 발현된 황화수소를 표적 하기 가능한 물질인지 확인했다. 따라서 세포내 발현된 황화수소를 표적하는 방사성 의약품으로서 [99mTc]Tc-gluconate는 사용 될 수 있는 잠재성이 있다. 하지만, 과정상 많은 제한점으로 확인하지 못한 종양모델에서의 [99mTc]Tc-gluconate 축적을 후속연구로 필요하다.

…………………………………………………………………… 주요어 : 저산소증, 지혈대, 허혈-재관류, 황화수소 (H2S), 형광 영상, 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영기, 테크네튬-99m 학 번 : 2018-20747

Objectives: Hydrogen sulfide is the third gasotransmitter that is known to be produced endogenously in hypoxia, various cancers and inflammations. H2S can be produced through both nonenzymatic and enzymatic pathways. It is reported that cystathione -lyase (CSE) localized in the cytosol in normoxia is translocated into mitochondria in hypoxia, and then metabolized to L-cysteine to produce H2S. Thus, production of H2S increases in hypoxic condition. Furthermore, it was reported that the endogenous H2S could be imaged by [99mTc]Tc-gluconate. In the president study, we tried to detect H2S generated by hypoxic cells in vitro, and tried to image H2S generated by hypoxic tissue in vivo using [99mTc]Tc-gluconate. Methods: Gluconate (0.3 M, 0.1 mL) was labeled with 99mTc in the presence of stannous chloride as a reducing agent. Radiochemical purity of [99mTc]Tc-gluconate was checked by radio TLC using two instant thin-layer chromatography strips (eluted with acetone and normal saline). In vitro cell uptake study of [99mTc]Tc-gluconate was performed in hypoxic and normoxic conditions using colon carcinoma cell line CT26. Hydrogen sulfide level was measured by a modified methylene blue method (absorbance was measured at 670 nm). For in vivo imaging study, acute hindlimb ischemia-reperfusion model was established in BALB/c mice after 3 h of ischemia and 3 h of reperfusion. [99mTc]Tc-gluconate (12.5 MBq) was intravenously injected into mice through tail vein and the lower limb uptake was imaged with SPECT/CT. Results: The labeling yield of [99mTc]Tc-gluconate was almost quantitative (99.8 ± 0.1%). In vitro, [99mTc]Tc-gluconate uptake to hypoxic cell was higher than normoxic cell in all the time. At 120 min of incubation, radioactivity in hypoxic and normoxic CT26 cells reached 109,772 ± 6,889 and 25,587 ± 1,884 CPM/mg, respectively, representing the H2S level in hypoxia was 40% higher than normoxia. In vivo, SPECT/CT imaging of [99mTc]Tc-gluconate showed five times higher uptake in ischemic limb than normal limb. The SUVmean of ischemic limb were 0.39 ± 0.03, and 0.07 ± 0.01 in normal limb. Conclusions: We demonstrated that [99mTc]Tc-gluconate is a novel imaging agent for endogenous hydrogen sulfide that is generated in hypoxic cells and tissues. Thus, it might be used for imaging various diseases related to hypoxia in clinical field.

Keyword : [99mTc]Tc-gluconate, SPECT/CT, Ischemia/Reperfusion injury, Hydrogen sulfide.