Peripheral Mechanisms of Nociception in Pathophysiological Conditions

Abstract

Pain sensations experienced in the body, as well as in the orofacial region, convey to the central nervous system (CNS) by peripheral sensory neurons such as the dorsal root ganglion (DRG) and the trigeminal ganglion (TG). Nociceptive pain, called nociception, begins at peripheral nerve endings of specialized peripheral sensory neurons known as nociceptors, which exclusively respond to noxious stimuli. Up to date, it has been well studied how the distinct nociceptors respond to various noxious stimuli such as heat, cold, chemical, or mechanical. However, it remains relatively little understood on mechanisms for how innocuous or non-painful stimuli, which would never be considered noxious, can cause pain. In this study, I have explored these polymodalities of nociception that may be elicited by innocuous stimuli or endogenous mediators of inflammation in several pathophysiological conditions as below. In the first chapter, I examined the contribution of peripheral γ–aminobutyric acid type A receptor (GABAAR) that may be activated by endogenous GABA produced in the inflamed tissue to inflammatory pain. Using complete Freunds adjuvant (CFA)-induced persistent inflammatory pain mouse model, I demonstrated that CFA-induced spontaneous nociceptive behavior and mechanical hypersensitivity were inhibited by intraplantar (i.pl.) injection of GABAAR antagonists. Moreover, local blockage of endogenous GABA with injection (i.pl.) of anti-GABA antibody attenuated CFA-induced mechanical hypersensitivity, whereas, i.pl. injection of a positive allosteric modulator of GABAAR facilitated mechanical allodynia in naïve mice. These findings suggest that peripheral GABAAR signaling contributes to CFA-induced hypersensitivity, and its modulation can potentially be a therapeutic target for inflammatory pain alleviation. In the second chapter, I investigated cellular mechanisms by which sweet substances excite dental primary afferent (DPA) neurons, thereby leading dentin hypersensitivity. Sweet substances contain high sugar concentrations so that they cause hyperosmolar conditions at the teeth. I thus demonstrated that the transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 8 (TRPM8), a well-known cold- and menthol-receptor, also served as a hyperosmosensor in DPA neurons. By applying a hyperosmolar sucrose solution to the mouse exposed tooth dentin, I investigated whether TRPM8 in DPA neurons mediates upregulation of c-fos expression as a marker of hyperosmolarity-induced nociception in the CNS level. I showed that hyperosmolarity-induced dental nociception was significantly attenuated by a selective TRPM8 antagonist, implying innocuous stimuli such as sweet substances can be sufficient to result in dental nociception via TRPM8 channels. In recent years, an increasing number of studies have successfully applied single-cell transcriptomics to characterize a population of cells and to identify rare subtypes or novel therapeutic targets in heterogeneous sensory system. In the third chapter, I thus employed transcriptional profiling using single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) and specific gene-expression validation with in situ hybridization in order to identify unique molecular signatures in the adult mouse DPA neurons. The single-cell transcriptome analysis detected six distinct clusters of DPA neurons. Interestingly, a particular cluster of DPA neurons was characterized by high expression of a low-threshold mechanosensitive Piezo2 ion channel and a pain-related neuropeptide Calca encoding CGRP (calcitonin gene-related peptide). These findings provide an insight into one of the previously proposed mechanisms underlying dentin hypersensitivity (i.e., hydrodynamic theory; Brännström and Astroem 1964), which is a common occurrence by innocuous mechanical irritations such as brush or air puffs. I further discussed mechanosensitive ion channels that may play critical roles in generating pain within the tooth pulp and their clinical implications.

신체와 구강악안면 영역에서 경험되는 통증 감각은 후근신경절(dorsal root ganglion)과 삼차신경절(trigeminal ganglion)과 같은 말초 감각 신경을 통해 중추 신경계로 전달된다. 일반적인 통증 감각은 유해감수기(nociceptor)로 불리는 특수한 말초 감각 신경의 말단에서 시작하고 이러한 유해감수기는 유해 자극에 주로 반응한다. 지금까지 열, 저온, 화학 물질 또는 기계적 자극과 같은 다양한 유해 자극에 반응하는 유해감수기에 대해서는 잘 연구되었지만 특수한 병태생리학적 상황에서는 무해한 자극도 통증을 일으킬 수 있는데, 이에 대한 기전은 아직 완전하게 규명되지 않았다. 따라서 본 학위 논문은 여러 유형의 병태생리 상태에서 무해 자극 또는 염증으로 인한 내생적 매개체(endogenous mediator)에 의해서 활성화될 수 있는 통증 감각의 기전을 세포, 분자 생물학 및 동물행동학적 수준에서 다음과 같이 탐구하고자 했다. 첫 번째 장에서는 염증 상태에서 내생적 감마아미노 낙산(GABA)에 의해 활성화 될 수 있는 감마아미노 낙산 유형 A 수용체(GABAAR)의 역할을 조사했다. CFA로 유도된 염증성 통증 마우스 모델을 사용하여, 후근신경절의 말단에 발현하고 있는 감마아미노 낙산 유형 A 수용체의 활성을 줄이기 위한 선택적 억제제의 사용 또는 항-감마아미노 낙산 항체를 염증 부위에 주사하여 내생적 감마아미노 낙산을 직접적으로 차단함으로써 조절했을 때, CFA로 유도된 자발적 통증 행동(spontaneous nociceptive behavior)과 기계적 자극에 대한 통각과민(mechanical hypersensitivity)이 감소했다. 이와는 반대로 감마아미노 낙산 유형 A 수용체의 활성을 양성 입체다른자리 조절자로 증가시켰을 때는 정상 마우스에서도 기계적 자극에 대한 이질통(mechanical allodynia)이 증가했다. 이를 통해 말초 감각 신경의 감마아미노 낙산 유형 A 수용체를 매개로 하는 신호 전달이 염증성 통증 조절을 위한 새로운 치료 표적이 될 수 있음을 입증했다. 두 번째 장에서는 단 물질이 어떻게 치수유래 일차 구심성 신경(dental primary afferent neuron)을 자극하여 상아질 과민증(dentin hypersensitivity)을 유발하는지에 대한 세포 기전을 탐색했다. 설탕 농도가 높은 단 물질은 삼투압이 높기 때문에 우리가 단 음식을 섭취할 때 치아는 고삼투압 상태가 되며, 단 음식은 치통을 빈번하게 유발한다. 따라서, TRPM8 이온 채널-저온과 멘톨 수용체로 잘 알려져 있지만 특별히 각막 신경에서는 각막의 건조와 같은 고삼투압 상태에서 눈의 깜빡임을 조절하는 것으로 보고됨-이 치수유래 일차 구심성 신경에서 고삼투압 자극에 활성화되어 통증 감각을 전달할 수 있음을 확인하고자 했다. 마우스의 치수유래 일차 구심성 신경 세포에는 TRPM8이 기능적으로 발현하고 있었으며, 살아있는 마우스의 치아 상아질을 노출시키고 고삼투압성의 설탕 용액을 적용함으로써 유발된 통증 감각이 TRPM8의 선택적 억제제에 의해서 현저하게 감소되는 것을 중추신경계 수준에서 확인했다. 따라서, 단 물질과 같은 무해한 자극이 TRPM8 채널을 통해 치통을 유발할 수 있음을 증명했다. 최근에 점점 더 많은 연구가 단일 세포 수준의 전사유전체학(single-cell transcriptomics)을 사용하여 혼합된 세포 집단 또는 복잡한 감각 신경 시스템에서 세포의 이종성, 희귀한 세포 유형, 새로운 치료 표적을 성공적으로 발견하고 있다. 세 번째 장에서는 마우스의 치수유래 일차 구심성 신경 세포에서 보이는 독특한 유전자 발현을 탐색하기 위해 단일 세포 수준의 RNA 시퀀싱(single-cell RNA sequencing) 기술과 현장혼성화(in situ hybridization) 조직 염색 기법을 도입했다. 단일 세포 수준의 전사체 프로파일링을 통해 치아 신경에서 여섯 개의 구별된 세포 집단(cluster)들이 존재하는 것을 발견했다. 흥미롭게도 가장 큰 집단은 약한 기계적 자극에 활성화 되는 Piezo2 이온 채널과 CGRP(칼시토닌 연관 단백질)를 부호화(encoding)하는 통증 관련 신경전달물질인 Calca의 높은 발현을 특징으로 했다. 이러한 발견은 치아의 신경세포가 피부 영역에 분포 되어 있는 다른 감각 신경과는 달리, 칫솔질 또는 공기 분사와 같은 약한 기계적 자극이 빈번하게 상아질 과민증을 발생시키는 기전을 설명하며, 이는 기존에 중요하게 제안된 유체역학 이론(hydrodynamic theory)을 입증했다. 추가적으로 나는 치통에 중요하게 관여할 수 있는 기계적 감각 이온 채널들과 본 연구의 임상적 적용에 대해서 논의했다.