Browse

Dynamics of transcription and transport of Arc mRNAs in live neurons
살아있는 뉴런에서의 Arc mRNA 전사과정과 움직임에 대한 연구

Cited 0 time in Web of Science Cited 0 time in Scopus
Authors
문형석
Advisor
박혜윤
Issue Date
2020
Publisher
서울대학교 대학원
Keywords
Arc mRNAtranscriptionRNA localizationdendritic transportsingle-molecule imaginglive-cell imaging전사RNA 쏠림 현상수상돌기내 운송과정단분자촬영살아있는 세포에서의 촬영
Description
학위논문 (박사) -- 서울대학교 대학원 : 자연과학대학 물리학과, 2020. 8. 박혜윤.
Abstract
RNA is not just an intermediate product in the process of gene expression but has its role especially in introducing asymmetry to biological systems. The invention of RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) led to numerous discoveries about RNAs new aspect as an active player in biological phenomena. Especially inside the brain or network of neurons, the asymmetric expression of genes involved in synaptic plasticity is critical for the proper formation of a memory. In this regard, an immediate-early gene (IEG) Arc has been a key molecule for understanding the mechanism of memory consolidation since its discovery in 1995.
Arc is an IEG that is rapidly and transiently transcribed after strong neural activity. This property has been used to evaluate which group of neurons underwent neural activity during various behavioral studies. Surprisingly after transcription, Arc mRNA was reported to localize near highly activated synapses. Arc is one of the special few genes which undergoes both neural activity-dependent transcription and localization of its mRNA to the activated synapses. However, these two phenomena were investigated by the FISH method which needs chemical fixation of the sample and thus the information about its dynamics was inaccessible. To overcome this problem, weve generated Arc-PBS mouse and was successful in real-time imaging of Arc mRNA transcription and transport in the live neuron at single-molecule resolution.
In this study, we generated an Arc-PBS mouse in which tandem repeats of PBS sequences are knocked in the 3´ untranslated region (UTR) of Arc genetic locus. By performing FISH and western blot, we confirmed PBS knock in on Arc 3´ UTR doesnt alter the Arc mRNA and protein expression level. Next, we investigated the correlation between Ca2+ activity and Arc transcription which is often believed to be in the relation of one to one correspondence. By directly measuring somatic Ca2+ spikes and Arc transcription from the same neuron for the first time, we observed only ~43 % of neurons transcribed Arc mRNA even after somatic Ca2+ bursts in dissociated hippocampal neuron culture. Afterward, by performing combined immunofluorescence with FISH, we showed phosphorylated CREB level has a positive correlation with Arc transcription suggesting that the ability to induce the Arc transcription might vary from neuron to neuron depending on their internal states. Finally, we observed the real-time transport dynamics of endogenous Arc mRNAs in the dendrite for the first time. The directed transport of Arc mRNA occurred in both anterograde and retrograde directions and was often interrupted by long pauses similar to the previously reported transport behavior of β-actin mRNA. The effect of neural activity on velocity, the occurrence of run in the anterograde or retrograde direction, and the portion of the moving Arc mRNAs was assessed. Surprisingly, none of these parameters were affected by global inhibition of ionotropic neural activity suggesting a mechanism that makes Arc mRNA localize to activated synapses is different from that of mitochondria.
Collectively, in this thesis, we first demonstrate the real-time single-molecule dynamics of endogenous Arc mRNA transcription and dendritic transport in live neurons. We could measure quantities that were impossible or extremely challenging to obtain by traditional fixed cell approaches. This innovative approach of imaging Arc mRNA in live neurons would help us elucidate the mechanism of memory consolidation by revealing its dynamic aspects.
RNA는 유전자 발현 과정에서의 중간 산물일 뿐만 아니라, 생물학적 시스템에 비대칭성을 도입하는 데에도 중요한 역할을 한다. RNA FISH (Fluorescence in situ hybridization)가 개발된 이후, 세포 내에서의 RNA쏠림 현상의 다양한 역할들이 발견되었다. 특히 뇌 속에서는 시냅스 가소성과 관련 있는 여러 유전자들의 비대칭적인 발현은 기억형성에 있어서 필수적이다. 이와 관련하여 1995년에 발견된 Immediate early gene (IEG)인 Arc 유전자는 기억형성의 원리를 이해하는 데 큰 도움이 되었다.
Arc 유전자에게는 매우 중요한 두 가지 고유한 특성이 있다. 첫째, Arc 유전자의 전사과정은 강한 신경자극을 받은 후에 빠르게 일어난다. 이러한 특성으로 인해 Arc 유전자의 전사과정은 동물에게 행동실험을 한 후, 어느 뉴런에서 신경 활동이 있었는 지 판별하는 지표로 오랫동안 사용되어 왔다. 둘째, 놀랍게도 Arc mRNA는 생성된 후 강한 자극을 받았던 시냅스 근처로 이동하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 신경자극에 의한 전사과정 개시와 신경자극을 받았던 시냅스로 모이는 특징 두 가지 모두를 가지는 유전자는 매우 드물다. 그러나 이 두 현상은 시료의 화학적 고정이 필요한 FISH 방법으로 연구되었으므로, 그 순차적 과정에 대한 정보는 얻을 수 없었다. 이 문제를 극복하기 위해, 우리는 Arc-PBS 마우스를 생성하였으며, 단일 분자 해상도로 살아있는 뉴런에서 Arc mRNA의 전사 및 이동과정을 실시간으로 촬영하는데 성공하였다.
이 논문에서 우리는 Arc 유전자의 3' 비번역부위에 반복된 PBS 서열을 삽입시킨 Arc-PBS 유전자변형 쥐를 개발하였다. RNA FISH와 웨스턴 블랏을 통해 PBS서열 삽입이 뉴런에서의 Arc mRNA양과 단백질 발현에 영향을 주지 않는 것을 확인하였다. 다음으로, 우리는 여태껏 일대일 대응 관계로 여겨졌었던 Ca2+ 활동과 Arc 전사활동 사이의 상관 관계를 조사하였다. 동일한 뉴런의 핵에서의 Ca2+ 활동과 Arc 전사과정을 처음으로 동시에 직접 측정함으로써, 해마로부터 배양한 신경세포에서는 Ca2+ 활동이 있었음에도 ~43 % 만이 Arc mRNA 전사과정을 개시하는 것을 관찰하였다. 또한, FISH와 면역 형광법을 함께 수행함으로써, 우리는 인산화된 CREB 단백질 양과 Arc mRNA 전사개시가 양의 상관 관계를 가짐을 관찰할 수 있었다. 이것은 Arc mRNA 전사과정을 개시하기 위한 역치 값이 뉴런마다 다를 수도 있다는 점을 제시한다. 마지막으로, 우리는 수상돌기에서 내생 Arc mRNA의 실시간 이동 과정을 단일분자 수준에서 처음으로 관찰하였다. Arc mRNA는 핵에서 멀어지는 방향과 핵으로 돌아오는 방향, 양방향으로 등속 이동하였고, 중간에 긴 멈춤 과정이 끼어 있었다. 이는 이전에 보고된 내생 β-actin mRNA의 수송 거동과 유사하였다. Arc mRNA가 신경자극을 강하게 받았던 시냅스로 쏠리는 현상을 이해하기 위해, Arc mRNA의 속도, 방향성 그리고 움직이는 비율에 대한 신경활동의 영향도 알아보았다. 놀랍게도, 이 수치들 중 어느 것도 이온 채널의 전체적인 억제에 의한 영향을 받지 않았다. 이는 Arc mRNA는 미토콘드리아처럼 실시간 주변 이온농도에 의해서 속도를 조정하는 방식이 아닌, 다른 원리로 활성화된 시냅스로 쏠린다는 점을 시사한다.
결론적으로, 본 논문에서는 처음으로 살아있는 뉴런에서 내생 Arc mRNA의 전사과정과 수상돌기에서의 수송과정을 단일분자 수준으로 실시간 측정하였다. 이를 통해 화학적 고정을 필요로 하는 기존 방식으로는 불가능하였던 Arc mRNA의 동역학과 관련된 양들을 측정할 수 있었다. 이처럼 살아있는 뉴런에서 Arc mRNA의 실시간 동역학을 관찰하는 혁신적인 방법은 기존 방식들로는 접근할 수 없었던 기억형성 과정의 원리를 밝히는 데 큰 기여를 할 것으로 기대된다.
Language
eng
URI
https://hdl.handle.net/10371/170666

http://dcollection.snu.ac.kr/common/orgView/000000161616
Files in This Item:
Appears in Collections:
College of Natural Sciences (자연과학대학)Dept. of Physics and Astronomy (물리·천문학부)Physics (물리학전공)Theses (Ph.D. / Sc.D._물리학전공)
  • mendeley

Items in S-Space are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.

Browse