Identification of human vitronectin-derived dimeric peptide and its effects on modulation of osteoclast differentiation

Abstract

Short bioactive peptides derived from extracellular matrix proteins are useful and attractive therapeutic agents for regenerative medicine and tissue engineering. Due to the various advantages of peptides, including their low cost, immunogenicity, and structural or functional flexibility, many studies have attempted to use them as regenerative medicine agents and to treat diseases. Attachment of cells to specific substrates is crucial for the modulation of specific cell responses in biomaterial design and development. Therefore, the identification of bioactive peptides that promote cell attachment is a critical strategy for bioactive peptide screening. Here, an IDAAFTRINCQG motif (VnP-8, residues 206-217), which promotes cell attachment, was identified in the hemopexin-like domain 1 of human vitronectin. Through spontaneous air oxidation reaction, the 12-mer monomeric peptide, VnP-8, was transformed into an 11-mer dimeric peptide (VnP-8-DN1 dimer) by removing the isoleucine residue at the N-terminus of VnP-8 and then forming a disulfide bond between cysteine residues. The VnP-8-DN1 dimeric peptide strongly enhanced cell attachment activity, and dimeric peptide-mediated cell attachment was significantly inhibited by heparin, which antagonizes heparan sulfate proteoglycan, and is slightly blocked by ethylenediaminetetraacetic acid, an integrin-ligand binding inhibitor. Furthermore, the VnP-8-DN1 dimer inhibited the macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL)-induced osteoclastogenesis. Additionally, the VnP-8-DN1 dimer increased the survival of bone marrow-derived macrophages and decreased the cellular level of c-Fms, a cell surface receptor of M-CSF, after which it reduced the expression level of receptor activator of nuclear factor-κB. These findings indicated that the VnP-8-DN1 dimer affected M-CSF signaling and blocked mitogen-activated protein kinase signaling induced by M-CSF or RANKL, which is critical for osteoclast differentiation. A pull-down assay using biotinylated VnP-8-DN1 dimers demonstrated that the peptide was associated with c-Fms, indicating that the VnP-8-DN1 dimer inhibits M-CSF and RANKL-induced osteoclastogenesis via c-Fms. Overall, these results highlight the potential applicability of the VnP-8-DN1 dimer as a bone disease and bone regeneration therapeutic agent by regulating osteoclast differentiation.

세포외기질단백질은 세포 부착, 이동, 분화, 증식 등 세포거동을 조절하므로 세포외기질단백질의 활성부위를 규명하여 생체활성 펩티드를 발굴하여 재생의학 및 조직공학에 이용하려는 연구가 활발히 이루어져 왔다. 펩티드는 합성의 용이성, 낮은 면역원성, 구조 및 기능적 유연성 등 많은 장점을 가지고 있다. 본 연구는 사람 비트로넥틴에서 세포활성을 갖는 생체활성 펩티드를 발굴하고, 발굴한 펩티드가 파골세포 분화 및 그의 분자기작에 미치는 영향에 관하여 연구하였다. 즉, 뼈 기질단백질인 사람 비트로넥틴의 homopexin 유사 도메인 1 에서 골모세포유사세포의 세포부착을 촉진시키는 12개 아마노산 잔기로 이루어진 펩티드(VnP-8)를 동정하였다. VnP-8 펩티드는 자연적 산화반응에 의해 C-말단에서 isoleucine 잔기가 제거되고 이황화결합에 의해 결합됨으로써 이량체인 VnP-8-DN1 dimer 펩티드를 형성하였다. VnP-8-DN1 dimer는 VnP-8보다 골모세포의 세포 부착과 퍼짐을 유의하게 촉진시켰으며, 헤파린 부착능을 보였고, 파골세포전구세포에서 파골세포로의 분화를 유의하게 억제시켰다. 펩티드를 배지에 첨가하였을 때에도 VnP-8-DN1 dimer는 파골세포의 초기 분화단계에 작용하여 파골세포 분화를 억제시켰다. 또한 VnP-8-DN1 dimer는 파골세포 분화에 중요한 M-CSF 또는 RANKL에 의해 유도되는 MAPKs 신호전달계를 억제하였으며 파골세포전구세포의 생존을 증가시키고, M-CSF의 세포표면수용체인 c-Fms 발현을 감소시켰다. 이는 VnP-8-DN1 dimer가 M-CSF 신호전달경로에 영향을 미친다는 것을 의미한다. 특히, VnP-8-DN1 dimer는 c-Fms와 상호작용하여 c-Fms의 세포 내 수준을 감소시켰고 RANK의 발현을 감소시켜 파골세포 분화를 억제시킴을 규명하였다. 본 연구결과를 종합할 때, VnP-8-DN1 dimer는 골모세포유사세포의 세포 부착을 촉진하고 파골세포전구세포에서 파골세포로의 분화를 조절함으로써 골질환 치료 및 골조직재생에 유용한 치료제로 사용될 수 있을 것으로 생각된다.