Functional Expression of Toll-Like Receptor 2 in the Trigeminal Ganglion Neurons

Abstract

Pattern recognition receptors (PRRs), such as Toll-Like Receptors (TLRs) expressed by immune cells, and play an important role in innate immunity in response to pathogens which enter into the host. PPRs in immune cells recognize pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) in pathogens, which activate intracellular signaling to release inflammatory cytokines. Recently, it has been reported that PRRs are also expressed on sensory neurons, and thus can directly recognize pathogens and modulate pain and inflammation. However, little is known about whether and what PRRs work in the trigeminal ganglia (TG). This study was aimed to determine various PRRs expressed in the TG by examining the molecular and functional expression of PRRs through RT-PCR, real-time PCR, and Fura-2 based Ca2+ imaging in the TG. PRRs were used such as NOD1 (Nucleotide Binding Oligomerization Domain Containing 1), NOD2, P2X7 (P2X purinoceptor 7), CD14 (Cluster of Differentiation 14), NLRP3 (NOD-, LRR- and Pyrin Domain-containing Protein 3), RAGE (Receptor for Advanced Glycation Endproducts), TLR1-7, TLR9, and these mRNAs were expressed overall in TG and dorsal root ganglia (DRG). Quantitative real-time PCR analysis confirmed that Toll-like receptor 2 (TLR2) was significantly higher in the TG. By using Ca2+ imaging, we confirmed that the intracellular Ca2+ responses of the TG neurons were observed with two agonists of TLR2 (Pam2CSK4, Pam3CSK4). When we further examined changes of TLR2, MyD88, TNF- and IL-1 mRNA expression in the TG after tooth pulp exposure, TLR2, MyD88, TNF- and IL-1 mRNA expression levels were increased in the ipsilateral TG compared to the contralateral TG. Also, the expression level of TLR2 was confirmed by single cell RT-PCR in dental primary afferent (DPA) neurons. Therefore, these results revealed that the molecular and functional expression of PRRs in the TG, and we suggest that TLR2 may play a functional role in tooth pain.

외부에서 병원균이 들어왔을 경우, 면역세포에 발현되어있는 톨-유사수용체 (Toll-Like Receptors, TLRs)와 같은 패턴인식수용체 (Pattern Recognition Receptors, PRRs)가 선천 면역에 중요한 역할을 한다. 이러한 표면수용체들을 통해 면역세포들은 병원체 연관 분자유형 (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)을 인식하여 세포 내 신호전달을 이루고 염증성 사이토카인의 분비를 유도하여 면역 방어 체계를 활성화하는 역할을 한다. 최근 들어, 패턴인식수용체는 감각신경세포에서도 발현되어 있어 병원균을 직접 인식하여 통증과 염증을 조절할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 하지만 감각신경세포에서 연구된 패턴인식수용체는 일부분이며 특히 삼차신경절 (Trigeminal Ganglia)에서 연구가 많이 이루어지지 않았다. 본 연구에서는 삼차신경절에서 어떤 종류의 패턴인식수용체가 발현되어 있는지를 규명하고자 하였다. 그리고 이를 규명하기 위하여 RT-PCR, real-time RT-PCR 및 Fura-2를 기반으로 한 칼슘이미징을 통해 패턴인식수용체의 분자 및 기능적 발현을 조사하였다. 삼차신경절과 척수후근신경절에서 패턴인식수용체인 NOD1 (Nucleotide Binding Oligomerization Domain Containing 1), NOD2, P2X7 (P2X purinoceptor 7), CD14 (Cluster of Differentiation 14), NLRP3 (NOD-, LRR- and Pyrin Domain-containing Protein 3), RAGE (Receptor for Advanced Glycation Endproducts), TLR1-7, TLR9 mRNA가 전반적으로 다 발현되어 있음을 확인하였다. 또한 real-time RT-PCR을 통해 정량적 분석을 한 결과, TLR2가 삼차신경절에서 척수후근신경절에 비해 상대적으로 유의미하게 높게 발현되어 있었다. 이를 바탕으로 TLR2의 기능적 발현을 조사하기 위해 진행한 칼슘이미징에서 TLR2의 두 가지 작용제 (Pam2CSK4, Pam3CSK4) 를 처리했을 때 약물에 의해서 세포 내 칼슘 농도가 증가되는 것을 확인하였다. 추가적으로 치수노출모델을 우측상악구치부 위치에 유발하고 삼차신경절에서 TLR2, MyD88, TNF-, 그리고 IL-1 mRNA 발현을 확인했을 때, 치수를 노출하지 않은 반대측 삼차신경절에 비해 치수를 노출한 삼차신경절에서 유의미하게 증가된 것을 확인하였다. 또한 dental primary afferent (DPA) neurons에서의 TLR2 mRNA 발현량은 single cell RT-PCR 기법을 통해 확인하였다. 따라서 이상의 연구결과를 통하여 삼차신경절에서 패턴인식수용체의 분자 및 기능적 발현을 확인하고, 더 나아가 치수노출모델에 적용하여 TLR2가 치아 통증에 있어 기능적 역할을 할 수 있음을 제시하였고 실제로 TLR2를 통한 통증전달이 일어나는지 규명하기 위한 후속연구가 필요하다.