characterization of low-adherent bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) acquisited by Bio-Matrix: (MSC derived extracellular matrix) Tissue-engineered bone regeneration in an experimental rabbit model

Abstract

-ABSTRACT- Characterization of Low-Adherent bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) acquisited by Bio-Matrix: (MSC derived extracellular matrix) Tissue-engineered bone regeneration in an experimental rabbit model.

Richeng Zheng Department of Prosthodontics, Graduate School, Seoul National University (Directed by Professor Seong-Kyun Kim, D.D.S., M.S.D., Ph.D.)

Purpose: Reconstruction and repair of the large size bone defects have always been a major issue for surgeons and their patients. Recently, mesenchymal stem cells (MSCs) have received widespread attention because of their potential utility in tissue engineering applications. It has been suggested that MSCs could exist in the nonadherent cell populations of bone marrow cell cultures, but all the nonadherent cells were discarded during media change. The aim of this study was to evaluate characterization of low-adherent bone marrow mesenchymal stem cells acquisited by bio-matrix(MSC derived extracellular matrix) in nonadherent bone marrow cells and to assess the cortical and cancellous bone regeneration by cell-based tissue-engineered in an experimental rabbit model. Materials and Methods: Bone marrow mesenchymal stem cells were aspirated from femur of rabbit. The primary cells were cultured in plastic dish and sub-cultured. Reconstitution of bio-matrix derived from bone marrow mesenchymal stem cells using Triton X-100. For the first time of media change, the nonadherent bone marrow cells were centrifuged and replated in bio-matrix coated dish. After 9~12days, the reattached cells in the bio-matrix coated dish were termed low-adherent BMMSCs. CFU-F (Colony-forming unit fibroblast) assay, BrdU, potentials for osteogenic, adipogenic differentiation and FACS were examined in both cell types in vitro. In vivo, the implant had upper and lower transverse canals served as a site for the cortical and cancellous bone space were filled with HA/TCP, HA/TCP + adherent BMMSCs, HA/TCP + low-adherent BMMSC and none (defect only, control) were installed into rabbit tibia. Histological and histomorphometric analysis were conducted for new bone formation after 4 weeks later. Results: The result showed that mesenchymal stem cells derived bio-matrix enhance cell acquisition and low-adherent BMMSCs have similar proliferation and differentiation potential as BMMSCs in vitro and the mean amount of bone regeneration in cortical was much more effective in adherent BMMSC+HA/TCP and low-adherent BMMSCs + HA/TCP group than HA/TCP and defect only group, and in the cancellous area adherent BMMSC + HA/TCP and low-adherent BMMSCs group were higher than defect only and HA/TCP group Conclusions: Low-adherent bone marrow mesenchymal stem cells acquisited by bio-matrix in nonadherent cell populations maintained similar potential characterization as the adherent bone marrow mesenchymal stem cells in vitro and in vivo.

Key words: Adherent bone marrow mesenchymal stem cells, bio-matrix, nonadherent cells, low-adherent bone marrow mesenchymal stem cells, tissue-engineered bone, bone regeneration Student number: 2010-24182

-국문초록-

바이오 매트릭스에 의해 획득한 Low-Adherent 골수 줄기세포의 특성: 토끼 모델에서 조직공학을 이용한 골 재생

정 일 성

서울대학교 대학원 치의학과 치과보철학전공 (지도교수 김 성 균)

1. 목적: 골 결함의 재건 및 수복은 구강악안면 영역, 임플란트 수술 등 여러 분야에서 많은 연구들이 행하여 왔다. 최근, 줄기세포의 잠재적인 utility가 조직공학 분야에서 광범위한 주목을 받고 있다. 또한 nonadherent 세포 중에 다량의 줄기세포 성질을 가진 세포가 존재한다고 보고 되였다. 본 연구는 바이오 매트릭스를 이용한 nonadherent 세포 중에서의low-adherent줄기세포의 특성 및 토끼 모델에서 조직공학을 이용한 골 재생 능력을 비교 평가한다. 2. 재료 및 방법: 가토를 이용하여 femur에서 골수 줄기세포를 분리 하였다. Primary 세포를 plastic dish에 배양 subculture 하였다. Triton-X 100 을 이용하여 바이오 매트릭스를 제작 하였다. Primary 배양 후 3일뒤 nonadherent 세포를 제작한 bio-matrix coated dish 와 plastic dish에 배양하였고 9~12일 동안 배양 후reattached 한 세포를 low-adherent 줄기세포라고 명명 하였다. Sub-culture후 CFU-F (Colony-forming unit fibroblast) assay, BrdU, FACS 및osteogenic, adipogenic 분화 실험을 진행하여 low-adherent줄기세포 의 특성을in vitro 에서 adherent 골수 줄기세포와 비교 분석하였다. 골 재생 능력을 평가하기 위하여 피질 골의 골 재생을 나타내는 1.5mm 직경의 상부 관과 해면 골의 골 재생을 나타내는 1.5mm 직경의 하부 관을 가진 임플란트를 다음의 4군으로 준비하였다. 1군: defect. 2군: only HA/TCP. 3군: Adherent BMMSC+HA/TCP. 4 군Low-adherent BMMSC+HA/TCP. 10마리의 뉴질랜드 가토에 40개의 임플란트를 경골에 식립 한 다음 4주뒤 조직계측학적 분석을 시행하여 각 관 내의 신생 골 면적을 측정하였다. 3. 결과: 줄기세포 기반의 바이오 매트릭스에 의해 획득한 low-adherent 골수 줄기세포는 CFU-F, BrdU, Differentiation, FACS 등 실험을 통해 기존의 골수 줄기세포와 비교할 때 비슷한 세포 성질을 나타냈다. 바이오 매트릭스는 osteogenic 잠재적인 성질을 가진 줄기세포의 획득에서 유효성을 보였고 조직공학을 이용한 토끼 모델 실험에서의 골 재생 결과를 볼 때 실험 4주후 피질 골 에서의 골 면적은 3군과 4군에서 1군과2군에 비해 유의하게 높았다. 해면 골 내의 골 면적에서도 3군과 4군에서 1군과 2군에 비해 비교적 많은 골 형성을 보여주었다. 4. 결론: nonadherent 골수 줄기세포 중에서 바이오 매트릭스에 의해 획득한 low-adherent 골수 줄기세포는 in vitro와 in vivo에서 기존의 adherent 골수 줄기세포의 성질을 가지고 있었다.

주요어: adherent골수 줄기세포, 바이오-매트릭스, nonadherent 세포, low-adherent 골수 줄기세포, 조직공학, 골 재생 학 번: 2010-24182