Effects of Fructo-Oligosaccharide Supplementation on Behaviors in Socially Isolated Mice

Abstract

생애 초기의 사회적 고립은 뇌 발달과 성인기 행동에 문제를 일으킬 수 있으며, 우울증과 같은 정신 질환에도 기여할 수 있음이 알려져 있다. 최근 연구들은 사회적 고립의 부정적 영향의 기전으로서 장-뇌 축을 통한 장내미생물의 역할에 주목하고 있다. 또한 이러한 메커니즘의 매개로서 뇌의 마이엘린화와 면역 체계가 관여할 수 있을 것으로 연구되고 있다. 식이섬유는 여러 연구 결과에서 장내미생물의 다양성과 조성을 바꾸었으며 장내미생물을 조절하는 요인으로 알려져 있다. 따라서 본 연구를 통해 프락토 올리고당이 장-뇌 축을 통하여 사회적 고립 마우스의 행동에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 이유 직후의 3주령 수컷 C57BL/6J 마우스를 무작위로 단체 사육군, 프락토 올리고당을 보충 섭취한 단체 사육군, 사회적 고립군, 프락토 올리고당을 보충 섭취한 사회적 고립 군으로 배정하였다. 단체 사육군의 경우 두 마리를 한 케이지에서 사육하였으며 사회적 고립군의 경우 한 마리를 한 케이지에서 사육하였다. 프락토 올리고당은 마시는 물에 녹여 13주간 자유급여 하였다. 10주차에 3주 동안 Open field 실험, Elevated plus maze 실험, three-chamber 실험, forced swim 실험과 같은 행동 실험을 실시하였다. 장내미생물은 16S rRNA 시퀀싱 분석을 통해 분석하였다. 뇌의 염증은 실시간 중합효소연쇄반응 실험으로 측정한 전 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNFα)의 발현 정도와 면역조직화학 실험을 통한 미세 아교 세포 관찰을 통해 분석하였다. 뇌의 마이엘린화 정도는 수초염기성 단백질의 발현 정도를 실시간 중합효소연쇄반응 실험을 이용하여 확인하였다. Open field 실험에서 사회적 고립군은 단체 사육군에 비해 더 많이 움직였다. Elevated plus maze 실험에서 전반적인 활동성을 나타내는 closed arm에 들어간 횟수와 arm에 들어간 전체 횟수가 사회적 고립군에서 단체 사육군보다 많았으며, 프락토 올리고당을 보충 섭취한 사회적 고립군은 단체 사육군과 유사하게 행동하였다. 또한 중앙에서 머무른 시간이 짧은 것을 통하여 사회적 고립군이 낮은 불안도를 보임을 확인하였으며, 프락토 올리고당을 보충 섭취한 사회적 고립군은 단체사육군과 유사하게 행동하였다. Three-chamber 실험에서 사회적 고립군은 비어 있는 챔버에 머무른 평균 시간이 마우스가 있는 챔버에 머무른 평균 시간보다 길었으며 이는 사회적 고립군의 낮은 사회성을 보여준다. 그러나 프락토 올리고당을 보충 섭취한 사회적 고립군에서는 이러한 결과가 나타나지 않았다. 장내미생물은 프락토 올리고당의 보충 섭취로 유의하게 변화하였다. 알파 다양성 지수의 한 종류인 Faiths phylogenetic diversity는 프락토 올리고당 보충 섭취군에서 높았고, 베타 다양성 또한 군들이 프락토 올리고당 보충 섭취로 분명히 나뉨을 보여주었다. 문(Phylum) 수준에서 Actinobacteriota, Proteobacteria, Verrucomicrobiota, Bacteroidota가 프락토 올리고당 보충 섭취로 변화하였다. 그러나 속(genus) 수준에서는 RF39, Blautia, LachnospiraceadFCS020이 사회적 고립군과 단체사육군에서 프락토 올리고당 보충 섭취로 인해 다르게 변화함을 발견하였다. Linear discriminant analysis effect size (LEFSe) 분석 또한 유사한 결과를 보였다. 이에 더하여 우리는 행동과 장내미생물이 유의하게 연관됨을 확인하였다. 해마에서 전 염증성 사이토카인 IL-1β과 TNFα가 사회적 고립군에서 낮았다. 해마의 미세 아교 세포의 숫자가 사회적 고립군에서 적은 경향을 보였으나 프락토 올리고당을 보충 섭취한 사회적 고립군의 경우 이러한 결과가 관찰되지 않았다. 뇌의 마이엘린화는 군 간에 유의한 차이를 보이지 않았다. 이러한 연구 결과는 프락토 올리고당의 보충 섭취가 해마의 염증 조절을 매개로 장-뇌 축을 통해 이유 직후 사회적 고립으로 유도된 행동 변화를 완화할 수 있음을 시사한다. 본 연구는 현대 사회에 심각한 정신 건강 문제에 새로운 접근법으로서 식이 요인을 제안한다는 점에서 그 의의가 있다.

Early-life social isolation is known to cause problems in brain development and adult behavior, and also to contribute to psychiatric disorders like depression. Accumulating studies support that gut microbiota is an underlying factor in adverse effects of social isolation through the gut-brain axis, and brain myelination and immune system are suggested as mediators of this mechanism. Dietary fiber, which changes gut microbiota diversity and composition, is one of regulatory factors of gut microbiota. Therefore, we aimed to study the effects of Fructo-Oligosaccharide (FOS) on behaviors of socially-isolated mice via gut-brain axis. We randomly assigned post-weaning, 3-week-old male C57BL/6J mice into four groups: group-housed without (GH-C) and with (GH-F) FOS supplementation, reared alone without (SI-C) and with (SI-F) FOS supplementation. Two mice were housed in each cage for GH groups and one mouse was housed in each cage for SI groups. FOS was supplemented by drinking water ad libitum for 13 weeks. Starting from week 10, we performed various behavior tests for 3 weeks. Specifically, we conducted open field test, elevated plus maze test, three-chamber test, and forced swim test. Gut microbiota analyses were performed using 16S rRNA sequencing. Inflammation in brain was checked by pro-inflammatory cytokine (IL-1β, IL-6, TNFα) levels using quantitative real-time PCR (qPCR), and by observing microglia using immunohistochemistry. Myelination in brain was confirmed by myelin basic protein (MBP) level using qPCR. SI groups moved further than GH groups in open field test. In elevated plus maze test, number of entries to closed arms and total number of entries to arms, which represent general activity, were higher in SI-C versus GH-C and were similar in SI-F and in GH-C. In addition, time spent in center was lower in SI-C compared to GH-C, indicating less anxiety in SI-C, while SI-F behaved similarly to GH-C. In three-chamber test, average time spent in the empty chamber was longer compared to that in the mouse containing chamber in SI-C group. This result represents low sociability of SI-C group, but it was not reproduced in SI-F group. Gut microbiota was significantly altered by FOS supplement. Faiths phylogenetic diversity, one of alpha-diversity indices, was higher in FOS-treated group. Beta diversity also showed that groups were definitely separated by FOS supplementation. Actinobacteriota, Proteobacteria, Verrucomicrobiota, Bacteroidota were changed by FOS supplementation in taxa phylum level. However, we found that RF39, Blautia and LachnospiraceadFCS020 were changed differently by FOS treatment in GH and in SI groups in taxa genus level. Linear discriminant analysis effect size (LEFSe) also confirmed similar result. In addition, we found that behavior and gut microbiota were significantly correlated. In hippocampus, pro-inflammatory cytokine IL-1β and TNFα were low in SI groups compared to GH groups. Microglia number seemed to have declined in SI-C compared to GH-C, but not in SI-F. Myelination in brain was not significantly different among groups. Our results imply that behavioral changes that are caused by post-weaning social isolation can be alleviated by FOS supplementation via gut-brain axis, and restoring of inflammation in hippocampus can be a mediator. This study suggests that dietary factor can be a novel approach to mental health problems, a serious issue in modern societies.