ACTL6A-mediated histone modifications regulate global gene expression in gastrointestinal cancer

Abstract

SWI/SNF 크로마틴 리모델링 복합체는 인간에게 발생하는 암의 20% 이상에서 변이되어 있다고 알려져 있다. SWI/SNF 복합체를 이루고 있는 다양한 단백질 유닛들의 분자 기전에 관한 연구는 활발히 진행되어 왔는데, 이는 암에서 각 SWI/SNF 복합체 유닛들의 크로마틴 구조 및 유전자 발현 조절 메커니즘을 규명함으로써 특이적이고 새로운 치료 전략을 세울 수 있다고 예측되기 때문이다. BAF53a 라고도 알려진 액틴 유사 단백질 ACTL6A는 SWI/SNF 크로마틴 리모델링 복합체를 이루는 유닛 중 하나로 알려져 있다. 이전 연구에서 CRISPR/Cas9 knockout 스크리닝을 통해 위암의 세포 성장에 영향을 미치는 후성유전학 변형인자인 ACTL6A를 발견하였다. 그러나, ACTL6A가 위장관암 증식에 관여하는 역할이나 메커니즘은 아직 보고된 바가 없다. 그렇기에 본 연구에서는 후성유전학 변형인자인 ACTL6A가 SWI/SNF 복합체의 일부로서 유전자를 조절하는 분자 기전을 규명하고자 한다. 먼저, CRISPR/Cas9과 shRNA 로 ACTL6A를 억제하면 위장관암의 세포 성장이 감소하였으며, 이때 CRISPR/Cas9 resistant 한 ACTL6A를 주입하면, 세포 성장이 다시 회복되었다. 마우스 생체 모델에서 ACTL6A를 억제했을 때에도 종양 성장이 억제되는 것을 확인함으로써 ACTL6A가 위장관암에서 세포 성장을 조율하는 역할이 있음을 확인하였다. SWI/SNF 복합체와 관련된 ACTL6A의 역할을 확인해 본 결과, SMARCA4, SMARCA2, 및 ARID1A 등의 다른 SWI/SNF 복합체 유닛들을 억제했을 때 보다, ACTL6A 억제 시 위장관암의 세포 성장이 더 효과적으로 감소하였다. 또한, ACTL6A는 SWI/SNF 복합체의 ATP 촉매 핵심 단백질인 SMARCA4/2의 단백질 안정성을 조절하였다. ACTL6A의 세포핵 내의 발현은 SMARCA4/2를 보유한 세포주와 보유하지 않은 세포주에서 동일하였다. 기존에 알려진 대로, SMARCA4/2가 없는 세포주에서 ACTL6A는 SWI/SNF 복합체와 구성체를 이루고 있지 않았다. 추가로, ACTL6A의 역할을 SMARCA4/2를 보유한 세포주와 보유하지 않은 세포주에서 확인해 본 결과, SMARCA4/2 유무와 관계없이 ACTL6A 억제 시 세포 성장이 효과적으로 감소하였다. 즉, ACTL6A는 SWI/SNF 복합체와 독립적인 전사 조절 기전도 보유한다고 예측할 수 있다. ACTL6A가 불활성화된 세포들의 전사체를 분석해본 결과, ACTL6A가 염색체 리모델링을 통해 전반적인 전사 조절을 한다는 것을 유추할 수 있었다. ACTL6A가 불활성화된 세포주를 사용해 ChIP-seq을 진행해본 결과, 히스톤 활성화의 지표인 H3K27Ac의 결합이 감소하였다. 이 결과들을 종합해본 결과, ACTL6A는 위장관암에서 유전자 전반적인 히스톤 변형을 일으킴으로써 유전자 발현 및 전사를 한다는 것을 확인하였다.

The mammalian SWI/SNF (Switching defective/sucrose non-fermentable) chromatin remodeling complex is mutated in over 20% of human cancer [1]. Mechanistic studies on various SWI/SNF complex subunits have been conducted to further understand SWI/SNF complex-mediated chromatin regulatory process. Better understanding of each SWI/SNF complex subunits epigenetic role in cancer could present novel and subunit-specific therapeutic opportunities. Actin-like protein 6A (ACTL6A), also known as BAF53a, is a subunit of SWI/SNF chromatin complex. ACTL6A was previously identified as an essential epigenetic modifier via CRISPR/Cas9 knockout library screening in gastrointestinal cancer [2]. However, the underlying mechanisms of ACTL6A in gastrointestinal cancer remain unknown. In the present study, I aim to identify the molecular mechanisms of epigenetic modifier ACTL6A in relation to SWI/SNF chromatin remodeling complex. Depletion of ACTL6A by CRISPR/Cas9 system and shRNA inhibition significantly impedes cell growth in gastrointestinal cancer. Introduction of CRISPR/Cas9-resistant ACTL6A clone in reversibility assay recovers cell growth. ACTL6A inhibition in mouse xenograft model in-vivo also shows decreased tumor growth, further verifying the cell proliferation regulating role of ACTL6A. Functional study of ACTL6A in relation to SWI/SNF complex reveals that the depletion of ACTL6A is more effective in cell growth inhibition compared to other SWI/SNF complex subunits such as SMARCA4, SMARCA2, and ARID1A. As a subunit of SWI/SNF complex, ACTL6A regulates protein stability of the catalytic subunits SMARCA4/2. Expression and nuclear localization of ACTL6A is consistent in SMARCA4/2 proficient and SMARCA4/2 deficient cell lines. I demonstrate that ACTL6A is not part of the SWI/SNF subcomplex that lacks SMARCA4/2, which is consistent with the findings from previous studies [3,4]. Interestingly, loss of function study of ACTL6A in SMARCA4/2 proficient and SMARCA4/2 deficient cell lines shows that ACTL6A inhibition effectively arrests cell proliferation regardless of SMARCA4/2 presence. This results suggests an additional role of ACTL6A, independent from SWI/SNF complex. Transcriptome sequencing of ACTL6A knockout cells indicates that ACTL6A regulates genome wide transcription via chromatin remodeling. ChIP-seq of ACTL6A knockout cells showed decreased genome-wide enrichment of histone activation marker, H3K27Ac. Collectively, my study presents that ACTL6A regulates genome-wide histone modifications and global gene transcription in gastrointestinal cancer.