Structural study of the mechanism of Wnt signaling inhibition by sclerostin

Abstract

Wnt signaling plays an important role in embryonic development, morphogenesis, and bone homeostasis. Wnt ligands bind to Frizzled receptors to induce several signal pathways. In particular, the low-density lipoprotein receptor-related protein 6 (LRP6) co-receptor is an essential participant in the β-catenin-dependent Wnt signaling pathway. The LRP6 ectodomain binds Wnt proteins as well as Wnt inhibitors such as sclerostin (SOST), which negatively regulates Wnt signaling in osteoblasts. SOST is thereby responsible for maintaining bone homeostasis by inhibiting osteoblast differentiation. Since a strategy to suppress SOST was proposed as a new method of osteoporosis treatment, structural studies have become increasingly important. Although LRP6 ectodomain 1 (E1) is known to interact with SOST, several unresolved questions remain, such as why SOST binds to LRP6 E1E2 with higher affinity than to the E1 domain alone. Here, I show the crystal structure of the LRP6 E1E2–SOST complex with two interaction sites in tandem. An unexpected additional binding site was identified between the C-terminus of SOST and the LRP6 E2 domain. This novel interaction was confirmed by microscale thermophoresis (MST)-based in vitro binding and cell-based Wnt signaling assays, and its functional significance was further demonstrated in vivo using Xenopus laevis embryos. Together, my results provide insights into the mechanisms underlying the SOST inhibition of Wnt signaling. Additionally, an advanced model of bone homeostasis regulation was established.

윈트 신호전달은 배아 발생, 형태 형성, 골 항상성 등에 있어서 중요한 역할을 담당한다. 윈트 리간드는 프리즐드 막관통수용체에 결합하여 여러 하위 신호를 유도하며 특히 베타-카테닌 의존 윈트 신호전달 경로에는 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질 6 (LRP6) 보조 수용체가 필수적으로 참여한다. 이 LRP6 단백질의 세포외도메인에는 윈트 단백질뿐만 아니라 다양한 조절자 단백질이 결합하여 정교하게 신호를 조율할 수 있다. 골조직에서 발현되는 스클레로스틴 (SOST) 단백질은 LRP6에 결합해 윈트 신호전달을 방해하는 조절자로 조골세포의 골세포 분화를 억제한다. 이를 통해 SOST는 골 형성 억제자로 기능하여 골 항상성 유지에 중요 역할을 담당한다. 이와 함께 SOST를 억제하는 전략이 골다공증 치료의 새로운 방법으로 제시되면서 관련 구조 연구와 복합체 연구가 중요해졌다. 과거 핵자기공명분광법 기반 SOST 구조분석과 LRP6 세포외도메인 1 (E1)-SOST 펩타이드 복합체 결정구조를 통해 SOST의 loop2 부분이 LRP6에 결합하여 WNT 신호전달을 방해한다고 알려져 있었다. 하지만 이러한 작용기전 모델은 SOST loop2 펩타이드보다 높은 SOST의 LRP6 결합력을 설명할 수 없었고 LRP6 세포외도메인 1 (E1) 보다 LRP6 세포외도메인 1-2 (E1E2)에 SOST가 더 높은 결합력을 보이는 현상 또한 설명할 수 없는 한계가 있었다. 본 연구에서는 X-ray 결정학을 통해 LRP6 E1E2-SOST 복합체의 삼차원 구조를 해석하였다. 밝혀낸 복합체 구조를 통해 SOST의 C-말단과 LRP6 E2 도메인 사이의 추가적인 결합 부위를 확인할 수 있었고 loop2 펩타이드와 더불어 두 개의 상호작용 부위가 나란히 있는 결합 모델을 제시하였다. 이 새로운 C-말단 상호작용 모델은 미세 규모 열 영동 (MST) 기반 in vitro 해리상수 측정 및 세포 기반 윈트 활성 분석을 통해 검증되었다. 추가적으로 Xenopus laevis 배아를 사용하여 생체 내에서 SOST의 loop2와 C-말단의 윈트 신호전달 억제 효과를 확인할 수 있었다. 이를 종합하여 분자 수준에서 윈트 신호전달에 대한 SOST의 새로운 억제 작용기전을 제시했고 골 항상성 조절의 정교한 모델을 세울 수 있었다.