Three-Dimensional Visualization and Quantification of the Whole Enteric Nervous System in Mouse and Human using Tissue Clearing

Abstract

BACKGROUND & AIMS: Nowadays, state-of-the-art tissue clearing methods enable visualization of the thicker tissue section or even whole organ imaging, by increasing tissue transparency and enhancing the antigen-antibody reaction. The goal of this research was to establish a 3D imaging method for the whole gastrointestinal (GI) tract that yields more information and insight about the enteric nervous system (ENS) than traditional 2D tissue section imaging. This approach will improve a comprehensive understanding of research purpose and diagnosis of human diseases, such as Hirschsprung disease, bowel motility disorders, or inflammatory bowel disease (IBD). The present study optimized a technique to image transgenic fluorescence mice and human ENS that express fluorescent neuron-specific class Ⅲ beta-tubulin (Tuj1), neuronal nitric oxide synthase (nNOS), choline acetyltransferase (ChAT), and RNA binding proteins (HuC/D) in 3 dimensions.

METHODS: Visualization and quantification of the digestive organs (e.g. esophagus, stomach, small intestine, and colon) in mice and humans were carried out through various techniques. A method, encompassing tissue clearing, immunohistochemistry (IHC), confocal microscopy, light sheet fluorescence microscopy (LSFM), and quantitative analysis of full-thickness bowel without tissue sections, had been established for 3D imaging at high resolution. Furthermore, using surface rendering, volume rendering for all channels, fluorescence thresholding, and background subtraction, tools from in IMARIS, cleared tissues could be visualized in an accurate 3D structure.

RESULTS: The multiscale structural decomposition of mouse and human ENS was clearly visualized in 3D. The tissue clearing method could image the complex ENS network structure of myenteric plexus, submucosal plexus, and mucosal nerves. Similarly, the 3D ENS network structure of the esophagus (16 × 14 × 5.3 mm) and colon (1.2 × 1.3 × 1.4 mm) samples were visualized in mouse and human, respectively. I investigated the cholinergic ENS structure through the whole GI tract and quantified the number of cell bodies and cell bodies per ganglion in myenteric and submucosal plexus in mouse (n=3). To identify the hubness of the myenteric plexus in mouse, I measured the number of ganglia and bridges without cell bodies that connected the ganglion. Quantitative data for myenteric plexus and submucosal plexus showed relatively different aspects.

CONCLUSIONS: This study was the first to visualize the mouse and human whole ENS in three dimensions with no sectioning and microanatomy. The cytoarchitecture of the mouse tissues could be quantitatively analyzed, preserving the tissue structure, and providing more accurate data with tissue clearing. A quantitative analysis method of structure phenotypes in mouse will illuminate the potential usefulness of this technology. For GI motility disorders, this novel technology will unravel the extensive spatial 3D network structure of neuro-immune interaction.

배경 및 목적: 오늘날의 최첨단 생체조직 투명화 기술은 조직 투명화와 항원-항체의 반응을 촉진시킴으로써 두꺼운 조직 또는 전 기관을 시각화 할 수 있게 한다. 본 연구는 위장관에 대한 조직의 2차원 이미지보다 장신경계에 대한 정보와 통찰력을 더 많이 산출하는 3차원 영상 방법을 개발하는 것이다. 이러한 접근방식은 염증성 장질환이나 장 운동성 장애와 같은 인간 질병에 대한 연구 목적과 진단에 대한 포괄적인 이해를 향상시킬 수 있으며 따라서 형질전환 쥐와 인간의 장신경계에서 베타 Ⅲ 튜블린 (Tuj1), 신경성 산화질소 합성효소 (nNOS)와 콜린아세틸트랜스퍼라아제 (ChAT), 형광신경의 RNA 결합 단백질 (HuC/D)을 3차원으로 시각화 하는 기법을 최적화하였다.

방법: 쥐와 사람의 소화기관 (식도, 위, 소장, 대장)을 시각화하고 정량화 하기 위해 다양한 기법으로 연구를 수행하였다. 고해상도의 3차원 영상을 얻기 위해 쥐와 사람의 조직을 사용하여 조직 투명화 기법, 면역화학염색 (IHC), 공초점 현미경, 시트 형광 현미경 (LSFM)과 전체 위장관 두께에 대한 정량적 분석을 수반한 방법들이 개발되었다. 나아가 IMARIS의 툴인 표면 렌더링, 모든 채널에 대한 볼륨 렌더링, 형광 임계치, 배경 제거 등을 사용하여 볼륨을 측정할 수 있는 정확한 3D 구조를 얻을 수 있었다.

결과: 쥐와 사람의 장신경계는 다양한 규모의 3차원으로 시각화 되었다. 큰 조직에서 3차원으로 면역염색과 이미징이 가능한 조직 투명화 방법은 근육층신경얼기, 점막하신경총과 점막 신경들의 네트워크를 보여주었다. 마찬가지로, 쥐의 식도 (16 × 14 × 5.3 mm) 와 사람의 대장 (1.2 × 1.3 × 1.4 mm) 조직 샘플에서도 3차원 장신경 네트워크 구조를 잘 보여주었다. 쥐(n=3)를 사용하여 장 전체에 분포하는 ChAT의 신경 구조를 연구하고, 두개의 주요 층에서 세포체와 신경절 당 세포체를 정량화 하였다. 근육신경얼기의 연결도를 확인하기 위해 신경절의 수와 신경절과 신경절을 이는 다리도 측정하였다. 근육층신경얼기와 점막하신경총의 정략적 데이터는 비교적 서로 다른 양상을 보여주었다. 더 나아가 쥐에서 억제성 신경과 흥분성 신경을 면역 염색하는데 성공하였다.

결론: 이 연구는 쥐와 사람의 조직 투명화 기술에 적합하고 장신경계의 구조와 신경회로 연구에 적용 가능성을 높일 것이다. 특히, 콜린 작동성 뉴런의 수를 정량화하는 방법에 대한 검증을 제공한다. 쥐의 구조 표현형의 정량적 분석 방법은 진단 마커로서 이 기술의 잠재적인 유용성을 조명하고 장 운동성 장애의 경우 이 새로운 기술이 신경면역의 상호작용에 대한 광범위한 3차원 네트워크 구조를 밝힐 것이다.