Regulatory Characteristics of the Fe-S Cluster-Containing Transcription Factors IscR and NsrR of Vibrio vulnificus in Response to Host-Derived Stress

Abstract

숙주 내에서 생존하고 성공적인 감염을 일으키기 위해서 병원성 박테리아는 숙주에서 유래한 스트레스를 인지하여 독성인자들의 발현을 적절하게 조절해야 한다. 이를 위하여 어떤 전사인자들은 산화 스트레스, 질산화 스트레스, 철의 결핍과 같은 다양한 환경적 신호에 민감한 철-황 클러스터를 보조인자로 활용한다. 본 연구는 치사율이 높은 식중독균인 비브리오패혈증균이 가지고 있는 두 개의 철-황 클러스터 결합 전사인자 IscR과 NsrR의 전사 조절 특성을 조사하였다. vvhBA 오페론에 의해 암호화되어 있는 세포용해/용혈인자 VvhA는 세포 밖으로 분비되는 세공 형성 독소로 비브리오패혈증균의 강력한 용혈 활성에 기여하는 독성인자이다. 전사체 및 전사물 분석 결과, vvhBA는 쥐의 혈액 또는 대식세포에 노출되었을 때 발현이 증가하였다. 돌연변이 분석을 통해 IscR이 철-황 클러스터를 파괴해 세포 내 apo-IscR 단백질의 양을 증가시키는 질산화 스트레스와 철의 결핍을 감지하여 vvhBA 오페론의 발현을 활성화시킨다는 것을 확인하였다. 흥미롭게도 IscR은 양성 조절자임에도 불구하고 vvhBA의 프로모터인 PvvhBA의 하부에 결합하였다. PvvhBA 조절 영역에서 IscR의 정확한 역할을 규명하기 위해 IscR과 또 다른 전사인자인 HlyU, H-NS의 상호작용을 조사하였다. HlyU는 PvvhBA의 상부에 직접적으로 결합하여 vvhBA의 전사를 활성화하는 반면, H-NS는 PvvhBA의 하부와 상부에 광범위하게 결합하여 vvhBA의 전사를 억제하였다. IscR과 HlyU의 결합 위치가 H-NS의 결합 위치와 중첩되어 있다는 관찰을 바탕으로, 추가적인 생화학적 분석들을 통해 IscR과 HlyU가 PvvhBA 조절 영역에 결합한 H-NS를 떼어내어 H-NS에 의한 억제를 완화함으로써 vvhBA의 발현을 유도한다는 것이 밝혀졌다. PvvhBA의 하부와 상부 모두에서 IscR과 HlyU가 동시에 발현 억제를 완화하는 것은 질산화 스트레스 및 철의 결핍과 같은 숙주 유래 스트레스 신호를 통합적으로 인식하여 vvhBA의 전사를 정확하게 조절하는 수단으로 활용되어 비브리오패혈증균이 숙주 감염을 성공적으로 일으킬 수 있도록 도울 것이다. 한편, 철-황 클러스터와 결합하고 있을 것으로 추측되는 비브리오패혈증균의 또 다른 전사인자 NsrR이 발굴되었다. 전사체 분석 결과, NsrR은 질산화 스트레스 대응에 관련되었을 것으로 추정되는 다수의 유전자들의 발현을 조절하였다. 특히, NsrR은 유독한 일산화질소를 효과적으로 분해하는 일산화질소 이산소화효소 암호화 유전자 hmpA의 강력한 음성 조절자로서 일산화질소에 노출되었을 때 hmpA의 발현 억제를 완화하였다. nsrR과 hmpA는 반대 방향으로 전사되는데, 그들의 프로모터 영역은 서로 중첩되어 위치하고 있었다. 분자생물학적 분석은 NsrR이 중첩된 프로모터 영역에 직접적으로 결합하며, 질산화 스트레스에 의해 철-황 클러스터가 손상되었을 때 DNA 결합 능력을 상실함으로써 hmpA의 발현 억제를 완화한다는 것을 증명하였다. 추가적인 생화학적 분석과 돌연변이 분석을 통해 Lrp가 nsrR-hmpA 조절 영역에 직접적으로 결합하여hmpA의 발현을 억제한다는 것을 확인하였다. Lrp의 hmpA 발현 억제 활성은 NsrR 의존적이었는데, 아마도 Lrp가 DNA의 형태를 변화시킴으로써 NsrR의 hmpA 발현 억제 활성을 강화하는 것으로 추정된다. 한편, CRP는 nsrR과 lrp의 프로모터 영역에 직접적으로 결합하여 이들의 발현을 억제함으로써 순차적으로 hmpA의 발현을 활성화하는 것으로 보인다. NsrR은 Lrp, CRP와의 협력적인 전사 조절을 통해 hmpA의 발현을 정교하게 제어하여 비브리오패혈증균이 숙주로부터 유래된 질산화 스트레스를 극복하고 생존하여 병을 일으킬 수 있도록 기여할 것이다.

To survive and establish successful infection within their hosts, pathogenic bacteria need to recognize host-derived stresses for the appropriate expression of virulence factors in a spatiotemporal manner. To this end, some transcription factors utilize an iron-sulfur (Fe-S) cluster as a cofactor, which is sensitive to various environmental stimuli such as oxidative stress, nitrosative stress, and iron starvation. In the present study, the regulatory characteristics of two Fe-S cluster-containing transcription factors, IscR and NsrR, of the fulminating food-borne pathogen Vibrio vulnificus have been investigated. A cytolysin/hemolysin VvhA encoded by the vvhBA operon is an extracellular pore-forming toxin, contributing to the powerful hemolytic activity of V. vulnificus. Transcriptome and transcript analyses showed that vvhBA is preferentially expressed upon exposure to murine blood and macrophages. Mutational analyses indicated that IscR activates the vvhBA operon in response to nitrosative stress and iron starvation, during which the Fe-S cluster is disrupted and the cellular apo-IscR protein level is increased. Interestingly, IscR directly binds downstream of the vvhBA promoter PvvhBA, which is unusual for a positive regulator. To investigate the exact role of IscR on the PvvhBA regulatory region, the interaction of IscR with other transcription factors HlyU and the histone-like nucleoid-structuring protein (H-NS) was examined. In addition to IscR, HlyU activates vvhBA transcription by directly binding upstream of PvvhBA, whereas H-NS represses vvhBA by extensively binding to both downstream and upstream regions of its promoter. Of note, the binding sites of IscR and HlyU overlapped with those of H-NS. Further biochemical analyses substantiated that IscR and HlyU outcompete H-NS for binding to the PvvhBA regulatory region, resulting in the release of H-NS repression and vvhBA induction. This concurrent antirepression by IscR and HlyU at regions both downstream and upstream of PvvhBA would provide V. vulnificus with the means of integrating host-derived stresses such as nitrosative stress and iron starvation for precise regulation of vvhBA transcription, thereby enabling successful host infection. On the other hand, another transcription factor NsrR predicted to contain the Fe-S cluster was identified in V. vulnificus. Transcriptome analysis showed that NsrR controls the expression of multiple genes potentially involved in nitrosative stress responses. Particularly, NsrR acts as a strong repressor of hmpA encoding a nitric oxide (NO) dioxygenase that effectively decomposes toxic NO, and mediates the derepression of hmpA upon exposure to NO. Notably, nsrR and hmpA are transcribed divergently, and their promoter regions overlap with each other. Molecular biological analyses revealed that NsrR directly binds to this overlapping promoter region, which is alleviated by loss of the Fe-S cluster, leading to the subsequent derepression of hmpA under nitrosative stress. Further biochemical and mutational analyses found that a leucine-responsive regulatory protein (Lrp) negatively regulates hmpA in an NsrR-dependent manner by directly binding to the promoter region, presumably resulting in a DNA conformation change to support the repression by NsrR. Meanwhile, a cyclic AMP receptor protein (CRP) positively regulates hmpA probably through repression of nsrR and lrp by directly binding to each promoter region in a sequential cascade. The collaborative regulation of NsrR along with Lrp and CRP enables an elaborate control of hmpA transcription, contributing to survival under host-derived nitrosative stress and the pathogenesis of V. vulnificus.