DNA 이중 가닥 손상 부위에서 RecQL4가 염색질 구조 변화에 미치는 영향 연구

Abstract

DNA 손상 중 가장 심각한 형태인 DNA 이중 가닥 손상(DNA double-strand breaks, DSBs)은 유전체 안정성에 직접적으로 영향을 미치기 때문에 반드시 수선되어야 한다. RecQL4는 DSBs의 주요 수선 기작인 비상동말단결합(Non-Homologous End Joining)과 상동 재조합(Homologous Recombination)에 모두 관여한다고 알려져 있지만, DSBs 발생 초기 수 초 내에 Poly(ADP-Ribose) Polymerase 1(PARP 1) 의존적으로 DSBs 부위에 결합한 후 수 분 내에 해리될 동안 DSBs 부위에 결합하여 정확히 어떤 역할을 수행하는지는 아직 밝혀진 바가 없다. 이에 본 연구에서는 RecQL4가 DSBs 부위의 염색질 구조 변화에 미치는 영향을 확인하고자 DSBs 부위로 모집되는 RecQL4의 최소 영역인 아미노산 360-437 영역과 GST가 융합된 단백질을 발현시켜 정제하였다. 이를 in vitro에서 바이오틴(biotin)이 결합 되어 있는 Poly(ADP-Ribose)(PAR)와 반응시켜 GST로 침전시키는 실험과 스트렙타비딘(Streptavidin)으로 침전시키는 실험을 각각 실시하였다. 실험 결과 RecQL4의 아미노산 360-437 영역이 PAR binding motif로 작용하여 직접적으로 PAR와 결합한다는 사실을 밝힘으로써 RecQL4가 PARylation된 염색질과 직접적으로 상호작용하여 염색질의 구조 변화를 유발시킬 수 있는 단백질임을 확인하였다. 또한 RecQL4가 DSBs 부위에서 히스톤 단백질 제거에 관여하는지 알아보고자 RecQL4의 발현을 억제한 DIvA 세포와 그렇지 않은 세포에 4-hydroxytamoxifen(4-OHT)을 처리해 DSBs를 유발한 후 Chromatin Immunoprecipitation(ChIP) - quantitative PCR(qPCR)을 진행하였다. 그 결과 RecQL4의 발현이 억제된 세포에서는 DSBs 부위에서 히스톤 단백질이 제거되지 않았고, RecQL4의 발현이 정상적으로 이루어진 세포에서만 히스톤 단백질이 제거되었다. 나아가 DSBs 부위의 PARylation된 히스톤 단백질을 인식하여 이를 제거하는데 관여한다고 알려진 FAcilitates Chromatin Transcription(FACT) 복합체가 DSBs 부위로 모집되는데 RecQL4가 어떤 영향을 미치는지를 확인하였다. RecQL4의 발현을 억제한 U2OS 세포와 그렇지 않은 세포에 FACT의 소단위체인 SSRP1에 EGFP를 융합해 발현시킨 후 레이저 미세조사를 통해 DSBs를 발생시켜 DSBs 부위로 모집되는 SSRP1의 양상을 관찰하였다. 연구 결과 RecQL4의 발현이 억제되면 SSRP1의 DSBs 부위로 모집되는 정도가 현저히 감소되었음을 확인하였다. 이를 통해 RecQL4가 DSBs 부위에서 히스톤 단백질 제거에 관여하며, FACT의 DSBs 부위 결합에도 관여한다는 사실을 밝혀내었다.

DNA double-strand breaks(DSBs), the most serious form of DNA damage, must be repaired because it directly affects genetic stability. RecQL4 is known to be involved in both non-homologous end joining(NHEJ) and homologous recombination(HR), the major repair mechanisms of DSBs, but it is not yet known what role it plays in the DSB site during dissociation within minutes after Poly(ADP-Ribose) Polymerase 1(PARP 1) dependent binding to DSB within seconds of occurrence. In this study, in order to confirm the effect of RecQL4 on the chromatin structure change of the DSBs site, GST fused with the amino acid 360-437 region, which is the minimum region of RecQL4 recruited to the DSBs site, were expressed and purified. In vitro, these proteins were incubated with biotin-labeled Poly(ADP-Ribose)(PAR) and pulled down with GST and Streptavidin, respectively. Experiments show that the amino acid 360-437 region of RecQL4 acts as a PAR binding motif and binds directly to PAR, confirming that RecQL4 is a protein that can interact directly with PARylated chromatin and cause structural changes in chromatin. In addition, to find out whether RecQL4 was involved in the removal of histone proteins from the DSBs site, 4-hydroxytamoxifen(4-OHT) was treated in DIvA cells that inhibited the expression of RecQL4 and cells that did not, causing DSBs, and then Chromatin Immunoprecipitation(ChIP) - quantitative PCR(qPCR) was used. As a result, histone proteins were not removed from the DSBs site in cells where RecQL4 expression was suppressed, and histone proteins were removed only from cells where RecQL4 was normally expressed. Moreovre, I examined how RecQL4 affects recruitment of FAcilitates Chromatin Transcription(FACT) complex known to be involved in recognizing and removing PARylated histone proteins in the DSBs site. EGFP fused with SSRP1, a subunit of FACT, was expressed in U2OS cells that inhibited the expression of RecQL4 and cells that did not. To generate DSBs, laser micro-irradiation was used and the pattern of SSRP1 recruited to the DSBs site was observed. This result shows that when the expression of RecQL4 was suppressed, the degree of recruitment to the DSBs site of SSRP1 was significantly reduced. Taken together, these results reveal that RecQL4 is involved in the removal of histone proteins from the DSBs site and also in the binding of the DSBs site of FACT.