패혈증 마우스 모델에서 소음손상에 의한 내이변화 관찰

Abstract

In modern society, the frequency of hearing damage caused by noise is gradually increasing. The number of patients with noise-induced hearing loss is gradually increasing, and the threat is growing in modern society as the possibility of exposure to various noises is increasing. Hearing loss, including noise-induced hearing loss, is accompanied by various social side effects, including social alienation and difficulty in communication. Nevertheless, noise-induced hearing loss has a lower public perception of the risk than the threat. Hearing damage caused by noise increases according to the intensity and exposure period of noise, and hearing damage to noise is known as risk factors such as aging, genetic predisposition, combination use of ototoxic drugs, and malnutrition. Systemic infections such as sepsis do not directly cause hearing loss, but it is known that hearing loss due to toxic drugs is more severe during systemic infection. In this study, we tried to check whether systemic infection worsens noise-induced hearing loss through a noise-induced hearing loss model and study the mechanism. An experiment was conducted on a model that applied 100 dB 1 hour of noise stimulation to C57BL/6 mice in a noise shielding box and induced transient threshold shift (TTS). Before noise treatment, the experimental group administered lipopolysaccharide (LPS), a cell wall component of E.coli, and the same amount of normal saline (NS) was injected in the control group. In the case of the experimental group, two concentrations were conducted to proceed with the analysis according to the concentration of infection: 1 mg/Kg and 5 mg/Kg. Auditory brainstem response threshold (ABRT) was measured and performed on 2 days (D2), 7 days (D7), and 14 days (D14) before drug treatment, respectively. D14 After hearing measurement, inner ear tissue was collected by sacrificing it. Statistical analysis of the results of the auditory brainstem response was performed through the repeated mesured ANOVA (rmANOVA) method. The degree of cell damage was confirmed in the hair cells through phalloidine staining, and the change in ribbon synapses was analyzed using CtBP2 staining. Images were taken after staining the hair cells and CtBP2 by immunochemistry. Images were counted using ImageJ. Statistical analysis of the results of the two coefficients was performed by the Mann-Whitney test. qPCR (quantitative polymerase chain reaction) was performed for machanical analysis through inflammatory marker. qPCR analysis was performed on a total of 6 inflammatory markers (TNF-a, NF-kB, TGF, IL1B, CD45, CCL2) in a total of 4 groups of NS only, NS+noise, LPS only, and LPS+noise. Statistical analysis of qPCR results was performed through the Jonckheer-Terpstra test. As a result of the auditory brainstem reaction, significant hearing loss was observed at 8 kHz in the LPS 5 mg/kg group compared to the LPS 1 mg/kg group and the control group (p<0.05). In this noise-induced hearing loss TTS model, no damage to outer hair cells was clearly observed in both the experimental group and the control group. On the other hand, the number of ribbon synapses in the LPS 5 mg/kg group decreased in the high-pitched region compared to the control group (p<0.05). Three markers (TNF-a, IL1B, CCL2) showing significant differences depending on whether or not systemic infection was obtained among the six inflammatory markers for evaluating the mechanism for susceptibility to noise-induced hearing loss during systemic infection. However, in the group that treated LPS and noise together, an increase in inflammatory markers was observed compared to the LPS group, but it did not reach statistical significance (0.05<p<0.5) According to functional and mechanical analysis, noise-induced hearing loss becomes more severe during systemic infection. This is a mechanism caused by a decrease in ribbon synapses in the inner ear, but it has not been confirmed whether inflammation increases inner ear damage. This study confirmed the possibility of systemic infection as a risk factor for noise-induced hearing loss and presents a research model that can be applied to various systemic infectious diseases. Based on the experimental results, the risk of noise stimulation in the treatment of systemic infection patients is confirmed. It provides guidelines for treatment of systemic infection patients.

현대사회에서 소음에 의한 청력손상의 빈도는 점차 증가하고 있다. 소음성 난청 환자는 점차 증가하고 있으며, 다양한 소음에 노출될 가능성이 커지고 있는 만큼 현대사회에서 그 위협이 커지고 있는 질환이다. 소음성 난청을 비롯한 난청은 사회적 소외와 의사소통의 어려움 등을 비롯한 다양한 사회적 부작용을 동반한다. 그럼에도 불구하고 소음성 난청은 그 위협에 비해 위험성에 대한 대중적인 인식이 낮다. 소음에 의한 청력손상은 소음의 강도와 노출기간에 따라 그 증가하며, 소음성에 대한 청력손상은 고령, 유전적 소인, 이독성 난청 약물의 병용사용, 영양실조 등이 위험요인으로 알려져 있다. 패혈증과 같은 전신감염은 직접 청력저하를 초래하지 않으나 전신감염시 이독성 약물에 의한 청력저하는 더 심한 양상으로 나타남이 알려져 있다. 본 연구에서는 전신감염이 소음성 난청을 악화시키는지 소음성 난청 모델을 통해 확인하고 그 기전에 대해 연구하고자 하였다. 소음차폐 상자에서 100 dB 1시간의 소음 자극을 C57BL/6 마우스에게 가해 일과성역치변화(Transient Threshold Shift, TTS)를 유도한 모델을 대상으로 실험을 진행하였다. 소음처치전 실험군은 E.coli의 세포벽성분인 지질다당질(Lipopolysaccharide, LPS)를 미정맥(tail vein) 투여하였고 대조군에서는 동량의 생리식염수(NS)를 주입하였다. 실험군의 경우 감염의 농도에 따른 분석을 진행하기 위해 1 mg/Kg, 5 mg/Kg의 두 가지의 농도로 진행되었다. 청력은 청성뇌간반응(Auditory brainstem response threshold, ABRT) 측정을 통해 이루어졌고 약물처치전(D0), 약물처치 후 2일(D2), 7일(D7), 14일(D14)에 각각 시행하였고, D14 청력측정 후 희생시켜 내이조직을 채취하였다. 청성뇌간반응 결과의 통계 분석은 반복배치 분산분석(repeated mesured ANOVA, rmANOVA)방식을 통해 시행하였다. 유모세포는 팔로이딘염색을 통해 세포손상정도를 확인하였으며, 리본 시냅스의 변화는 CtBP2 (C-Terminal Binding Protein 2) 염색을 이용하여 분석하였다. 유모세포와 CtBP2 면역화학조직염색 후 촬영한 이미지는 ImageJ를 이용하여 계수하였다. 두 계수의 결과에 대한 통계 분석은 Mann-whitney검정에 의해 시행하였다. 염증마커분석을 통한 기전적 분석을 위해서는 qPCR (quantitative Polymerase Chain Reaction)을 시행하였다. qPCR분석은 NS only, NS+noise, LPS only, LPS+noise의 총 4개 군에서 총 6개의 염증 마커 TNF-a (Tumor necrosis factor alpha), NF-kB (Nuclear factor kappa B subunit 1), TGF-b (Transforming growth factor beta), IL1B (Interleukin 1 beta), CD45 (Protein tyrosine phosphatase, receptor type, C), CCL2 (C-C Motif Chemokine Ligand 2)에 대하여 시행하였다. qPCR결과에 대한 통계 분석은 Jonckheer-Terpstra 검정을 통해 시행하였다. 청성뇌간반응 결과 LPS 5 mg/kg군에서 LPS 1 mg/kg군과 대조군에 비해 8kHz에서 유의한 청력저하가 관찰되었다(p<0.05). 본 소음성난청 TTS모델에서는 실험군과 대조군 모두에서 외유모세포의 손상은 뚜렷히 관찰되지 않았다. 반면, 대조군에 비해 LPS 5 mg/kg군의 리본 시냅스 개수는 고음역대 영역에서 감소하였다(p<0.05). 전신감염시 소음성난청의 취약성에 대한 기전을 평가하기 위한 6개의 염증마커 중 전신감염 여부에 따라 유의한 차이를 보이는 마커 3개(TNF-a, IL1B, CCL2)를 확보하였다. 다만 LPS와 소음을 함께 처치한 군에서 LPS군에 비하여 염증마커의 증가는 관찰되었으나 통계적인 유의성에는 미치지 못하였다(0.05<p<0.5) 기능적, 기전적 분석에 따라 전신감염시 소음성 난청은 더 심화된다. 이는 내이 내 리본 시냅스의 감소에 의한 기전이나 염증이 내이손상을 증가시키는지에 대한 기전을 확인하지는 못하였다 본 연구는 전신감염의 소음성 난청에 대한 위험요소임의 가능성을 확인하였고 다양한 전신감염 질환에 적용될 수 있는 연구 모델을 제시한다. 실험 결과를 바탕으로 전신감염 환자들의 치료에 있어 소음 자극의 위험성을 확인하고 치료를 위한 가이드라인을 제시한다.