Generation of antibodies and characterization of interactions for Rice stripe virus proteins

Abstract

벼줄무늬잎마름병바이러스 (RSV) 는 벼에게 있어서 가장 치명적인 바이러스 중 하나이며, 벼의 대부분인 자포니카 품종을 재배하고 있는 중국, 일본과 한국의 쌀 생산량을 현저하게 감소시킨다. RSV는 지속적이고 순환적 전파 방식으로 작은 애멸구 (SBPH) 를 통해 전염된다. RSV는 현재 Tenuivirus 종에 포함되지만, 아직 바이러스의 속에 해당 되지 않는다. RSV의 게놈은 네 개의 단일 가닥 RNA (RNA1–RNA4) 로 구성되어 있으며, 일곱개의 단백질을 암호화 한다. 본 연구에서는 RSV 단백질의 단백질-단백질간의 상호작용을 중점적으로 다루었다. 먼저, RSV에 감염된 벼로부터 RSV 단백질을 검출하기 위해서, RSV에 대한 항체는 재조합 단백질과 합성된 폴리팹타이드를 이용하여 생성되었다. 7개 RSV 단백질 가운데, NCP와 NS3 단백질을 암호화하는 유전자는 RT-PCR를 통해 증폭 후 재조합 단백질 발현벡터에 클로닝하였고 Escherichia coli 를 이용한 과발현 방법을 이용, 최종적으로 정제된 재조합 단백질을 얻을 수 있었다. 항체 생성을 위한 다른 방법으로는 RSV단백질 염기서열을 이용한 폴리펩타이드를 합성하고, 이를 이용하여 항체를 생성하였다. 최종적으로 두 개의 재조합단백질과 네 개의 합성 폴리팹타이드를 포함하는 여섯 개의 다클론성항체들을 확보하였다. Western blot analysis을 통하여 NCP를 항원으로 사용하여 제작한 항체가 안정적인 단백질 검출 결과를 보였고, 합성 폴리팹타이드의 경우, NP와 NCP 합성 펩타이드를 이용한 항체를 이용할 때 RSV에 감염된 벼와 담배로부터 RSV를 검출하는데 성공하였다. 그러나 NS3와 NSvc4 항체의 경우, 다른 RSV 단백질과의 비특이적인 상호작용으로 인하여 약하거나 비 특이적 결합반응을 보여주었다. 요약해보면, 본 연구를 통하여 제작된 RSV 항체를 이용하여 이병식물에서 RSV를 진단, Immunoprecipitation, 단백질 정제와 Western blot analysis 등 다방면에서 유용할 것으로 사료된다. 둘째, 본 연구에서는 yeast-two hybrid (Y2H) 분석과 Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) 을 통하여 RSV의 여섯 개의 단백질 간의 상호작용 관계를 조사하였다. Nucleocapsid protein (NP) 와 NS3 단백질과의 상호작용을 연구하기 위하여 Y2H 연구를 수행하였고 BiFC 연구를 통하여 NP, NS3, NCP 사이의 상호작용에 관한 결론을 도출하였다. NP 단백질 상호작용에 관련한 중요한 아미노산 (AA) 의 잔기들과 위치를 알아내기 위하여 도메인 및 아미노산 치환 돌연변이를 제작하여 연구에 사용하였다. 또한 Y2H 분석을 통해 NP 상호 작용에 있어서NP의 N--아미노말단 영역 (AA 1-56) 필요 하다는 실험적인 결과를 얻었다. 추가적인 아미노산 치환 돌연변이를 이용하여 42번째 부터47번째 있는 아미노산이 전반적인 NP 상호작용에 영향을 준다는 것을 보여줬다. 이러한 결과들은 NP 단백질의 N-아미노 말단 영역 (AA 36 과 AA 42-47) 이 NP 단백질의 상호 작용을 위해 필요하다는 것을 보여준다. BiFC와 Co-localization 연구에서도 NP 단백질이 상호작용을 보이는 위치가 식물 세포 핵 주변이고 NP 단백질의 핵 이동에 N-아미노말단 영역이 필요하다는 결론을 보여줬다. 결과적으로, 본 연구를 통해 NP 의 N-아미노 말단 영역 (AA1-47)은 NP 상호작용의 중요한 요소이고, 여섯 개의 아미노산 잔기들(42-47)은 NP 상호 작용뿐만 아니라 핵 국소화에 필수불가결하다는 사실이 도출되었다.

Rice stripe virus (RSV) is one of the most destructive viruses of rice, and greatly reduces rice production in China, Japan, and Korea, where mostly japonica cultivars of rice are grown. RSV is transmitted by the small brown plant-hopper (SBPH) in a persistent and circulative-propagative manner. RSV belongs to the genus Tenuivirus but has not yet been assigned to a virus family. The RSV genome is composed of four single-strand RNAs (RNA1 to RNA4) and encodes seven proteins. In the present study, we investigated the protein–protein interaction of RSV proteins. First, in order to detect RSV proteins in RSV infected rice, antibodies for RSV were generated on the basis of recombinant proteins and synthetic polypeptides as antigens. Among seven proteins in RSV, genes encoding NCP and NS3 proteins were cloned into the expression vector carrying His-tag after RT-PCR amplification. We obtained purified His-tagged recombinant proteins which were produced in Escherichia coli. Alternately, we also applied synthetic polypeptides of RSV proteins which are suitable to raise antiserum for antibody production. A total of six polyclonal antibodies consisted of two recombinant proteins and four synthetic polypeptides were raised in rabbits. Of two recombinant proteins, only anti-NCP displayed stable hybridization signals in western blot analysis. In case of synthetic polypeptides, antibodies for NP and NCP were very effective to detect RSV in both RSV infected rice and weed plants. However, antibodies for NS3 and NSvc4 showed weak specific bands as well as strong non-specific background due to the difference of viral proteins produced in the infected leaves. In summary, the antibodies generated for RSV in this study will be useful for various assays such as RSV diagnostic detection, immunoprecipitation, protein purification, and western blot analysis. Second, we investigated interactions between six of the RSV proteins by yeast-two hybrid (Y2H) assay in vitro and by bimolecular fluorescence complementation (BiFC) in planta. Y2H identified self-interaction of the nucleocapsid protein (NP) and NS3, while BiFC revealed self-interaction of NP, NS3, and NCP. To identify regions(s) and/or crucial amino acid (aa) residues required for NP self-interaction, we generated various truncated and aa substitution mutants. Y2H assay showed that the N-terminal region of NP (aa 1–56) is necessary for NP self-interaction. Further analysis with substitution mutants demonstrated that additional aa residues located at 42–47 affected their interaction with full-length NP. These results indicate that the N-terminal region (aa 1–36 and 42–47) is required for NP self-interaction. BiFC and co-localization studies showed that the region required for NP self-interaction is also required for NP localization at the nucleus. Overall, our results indicate that the N-terminal region (aa 1–47) of the NP is important for NP self-interaction and that six aa residues (42–47) are essential for both NP self-interaction and nuclear localization.