Structural Optimization for Thermal Stabilization of Adenylate Kinases

Abstract

열에 안정한 단백질은 반응의 효율을 증가시키는 측면과 효소 저장 및 운반에 이용되는 비용 절감 등의 산업적, 실험적 환경에 필수적이다. 따라서, 이를 위한 단백질 재 디자인 방법들이 오랜 기간동안 다양한 시도들이 연구되고 있다. 그럼에도 불구하고, 지금까지 알려진 방법들은 이의 결과들이 예측이 힘들고, 재디자인 결과가 열 안정성에 크게 영향을 주지 않는 문제점을 가지고 있다. 본 연구자는, 여러가지 열 안정성에 관련된 기술들의 효과를 테스트 하였다. 이를 바탕으로, 개별적이고 통합적인 방법으로 단백질을 재디자인하여 어떠한 메커니즘이 단백질 열 안정성에 영향을 미치는 역할을 하는지 제공한다. 본 연구의 모델로서, 중온성 아데닐레이트 카이네이즈 (AKmeso) 에 바이오인포메틱스 방법인 local structural entropy 최적화, 삼차원적 구조를 바탕으로한 돌연변이 생성, 분자생물학적인 진화법을 적용하였다. 이 방법들을 개별적과 통합적으로 적용하여, 아데닐레이트 카이네이즈 돌연변이 (AK variants) 를 생성하고, 각 AK variant 의 열 안정성을 측정하였다. 재 디자인된 AK variants 는 야행형인 AKmeso 보다 향상된 열 안정성을 가지며, 높은 온도에서 효소 활성을 나타냈다. 호열성인 아데닐레이트 카이네이즈와 유사한 열 안정성을 가지는 AK variant 인 AK v18 을 포함하여, 디자인에 관련된 대표적인 AK variants 의 단백질 결정을 이용한 삼차원적 구조 규명 하였다. 이를 통하여, AK variants 의 단백질 구조를 확인하였고, AK variant 에 적용된 열 안정성 관련 방법의 효과를 분석하였다. 이러한 실험의 결과를 통하여, 아데닐레이트 카이네이즈의 열 안정성과 관련된 메커니즘의 역할를 확인할 수 있었다. 이를 바탕으로 열에 안정한 단백질을 디자인 함에 있어서, 여러 방법들을 개별적 및 통합적으로 이용하였을 때, 보다 효과적으로 적용시킬 수 있는 방법을 제시하고 있다.

Thermally stable proteins are desirable in many industrial and laboratory settings. Numerous approaches have been developed to redesign proteins for higher thermal stability. However, these approaches are sometimes unpredictable and bring no significant change. In this study, I systematically tested the effects of multiple stabilization techniques, thereby suggesting an integrated approach for improving protein thermal stability. Using a mesophilic adenylate kinase from Bacillus subtilis (AKmeso) as a model protein, I identified mutations important for thermal stability, based on various techniques including local structural entropy optimization, structureguided mutagenesis, and molecular evolution. Variants of adenylate kinase (AK) harboring single or multiple mutations were generated and the changes in their thermal stabilities were measured. Compared to AKmeso, the AK variants displayed higher thermal denaturation midpoints with retained enzymatic activity at high temperatures. In addition, I solved crystal structures of representative AK variants to confirm the effects of the generated mutations affecting the thermal stability. These results provide a unique example of the integrated and systematic approaches for protein thermal stabilization.