나무딸기 과일의 항산화·항염증 효과

Abstract

염증반응으로 인한 염증성 물질 분비와 산화적 스트레스의 증가는 세포 내의 항산화 방어체계와 활성 산소종(reactive oxygen species

ROS) 사이의 불균형을 초래하고 조직의 단백질, 지질, DNA 등을 손상시킨다. 이러한 염증반응에서 항산화 물질은 산화적 스트레스와 염증성 물질의 분비를 감소시킴으로써 만성 염증성 질환의 예방과 완화에 도움을 줄 수 있는 것으로 알려져 있다. 나무딸기류(Rubus)의 과일은 폴리페놀을 다량 함유하고 있어 항산화능이 높으며, 특히 안토시아닌의 함량이 매우 높아 항염증 효과가 기대된다. 그러나 국내에서 재배된 다양한 나무딸기 과일이 함유한 폴리페놀이 직접적인 ROS 생성이나 염증반응으로 유발되는 산화적 스트레스에 미치는 영향에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 이에 본 연구에서는 블랙라즈베리(Rubus occidentalis), 블랙베리(Rubus fruticosus), 복분자(Rubus coreanus Miquel) 과일의 항산화 성분과 항산화능을 비교하고, 대식세포주(RAW264.7)와 대장상피세포주(Caco-2)를 이용하여 과일에서 분리한 안토시아닌과 폴리페놀이 산화적 스트레스와 만성 염증상태에 미치는 영향을 확인하였다. 또한 동물 모델에서 블랙라즈베리 동결건조물의 섭취가 난소절제로 인해 증가하는 산화적 스트레스 및 염증반응에 미치는 영향을 검토하였다. 나무딸기 과일의 항산화 성분과 항산화능을 비교한 결과, 블랙라즈베리의 폴리페놀, 플라보노이드, 안토시아닌의 함량이 유의적으로 높았고, 항산화능도 가장 높았다. 또한, 과일에서 분리한 안토시아닌 분획의 조성을 분석한 결과, 블랙라즈베리에는 cyanidin-3-rutinoside(C3R)가 60.1%, 블랙베리와 복분자에는 cyanidin-3-glucoside(C3G)가 각각 82.3%와 72.7%로 가장 많았다. 산화적으로 자극한 RAW 264.7 세포주를 이용하여 안토시아닌 분획과 개별 안토시아닌(C3G, C3R)의 항산화 활성을 확인한 결과, 20μg/mL의 안토시아닌 분획, C3G, C3R은 hydrogen peroxide(H2O2) 처리로 인한 세포 내의 ROS 증가를 유의적으로 억제했다(p<0.05). 또한, nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 2(Nrf2)의 단백질 발현을 유의적으로 증가시켰으며,(p<0.05), 이로 인해 superoxide dismutase(SOD)와 glutathione peroxidase(GPx)의 활성이 증가하여 세포의 항산화능을 높였을 것으로 보인다. 20μg/mL의 안토시아닌 분획, C3G, C3R은 hydrogen peroxide(H2O2) 처리로 인한 핵 내의 DNA의 손상도 유의적으로 억제했다(p<0.05). 또한, 안토시아닌 분획, C3G, C3R은 lipopolysaccharide(LPS)로 자극한 RAW 264.7 세포주에서 inhibitory kappa Bα(I-κBα)의 단백질 발현을 유지시켜 nuclear factor kappa B(NF-κB)의 활성을 억제시키고, inducible nitric oxide synthase(iNOS)와 cyclooxygenase-2(COX-2)의 단백질 발현을 유의적으로 억제시켰다. 이것은 LPS로 자극한 대식세포에서 분비되는 nitric oxide(NO)나 prostaglandin E2(PGE2)를 감소시킨 결과와도 일치했다. 과일의 안토시아닌 분획, C3G, C3R은 LPS로 자극한 RAW 264.7 세포주에서 Nrf2의 단백질 발현을 증가시켰고, intercellular adhesion molecule 1(ICAM-1)의 단백질 발현은 유의적으로 감소시켰지만(p<0.05), cluster of differentiation(CD) 62L(L-selectin)의 발현에는 영향을 주지 않았다. 또한, 과일의 안토시아닌 분획, C3G, C3R(20 μg/mL)은 LPS로 자극한 RAW 264.7 세포주의 배양액(conditioned medium)으로 염증반응을 유도한 Caco-2 세포주에서도 NF-κB와 iNOS의 단백질 발현을 억제시키고, 세포에서 분비되는 NO를 유의적으로 감소시켰다(p<0.05). 과일의 안토시아닌 분획, C3G, C3R(20 μg/mL)은 CM으로 자극한 Caco-2 세포주에서 Nrf2의 단백질 발현을 증가시키고, ICAM-1의 단백질 발현을 유의적 감소시켰지만(p<0.05), L-selectin의 단백질 발현에는 영향을 주지 않았다. 위와 같은 결과를 토대로 나무딸기류 과일의 안토시아닌 분획과 안토시아닌이 산화적 스트레스를 가한 RAW 264.7 세포주 내의 ROS를 소거하는 동시에 항산화 활성을 높이고, LPS로 자극한 RAW 264.7 세포주에서 염증물질의 생성을 감소시킴을 확인하였다. 그러므로 이어지는 연구에서는 세 종류의 나무딸기 중에서 폴리페놀 함량과 항산화능이 가장 높은 블랙라즈베리가 LPS로 자극한 대식세포에서 염증으로 인한 산화적 스트레스도 감소시킬 수 있는지 검토하였다. 그 결과, 블랙라즈베리에서 분리한 안토시아닌 분획물과 비안토시아닌 폴리페놀 분획물의 항산화 활성이 염증을 유발한 세포 내에서도 유효하며, 염증반응으로 인해 발생하는 세포 내의 ROS와 DNA 산화를 감소시켜 과도한 염증반응을 감소시킬 수 있음을 확인했다. 또한, 동물 모델에서 8주간의 블랙라즈베리 동결건조물의 섭취가 난소절제로 인해 증가되는 산화적 스트레스 및 염증반응의 완화에 미치는 영향을 검토하였다. 실험군은 총 5군으로 Sham 군(Sham, n=8), 난소절제+에스트로겐 펠렛 삽입군(ES, n=8), 난소절제+플라시보 펠렛 삽입군(NC, n=10), 난소절제+플라시보 펠렛+2%(w/w) 블랙라즈베리 건조물 첨가군(BR2%, n=8), 난소절제+플라시보 펠렛+5%(w/w) 블랙라즈베리 건조물 첨가군(BR5%, n=8)이었다. 실험기간 동안 식이섭취량은 군간의 차이가 없었으며, ES와 Sham 군의 체중이 NC, BR2%, BR5% 군의 체중보다 유의적으로 낮았다(p<0.05). 또한, 혈청과 간의 중성지방과 총 콜레스테롤은 2%와 5%의 블랙라즈베리를 섭취했을 때 농도 의존적으로 낮았고, NC 군과의 차이는 없었다. 혈청 malondialdehyde (MDA)는 2%와 5%의 블랙라즈베리를 섭취한 군이 NC 군보다 낮았고, BR5% 군이 ES 군과 NC 군보다 각각 27.4%와 24.9% 낮았다. 산화 LDL은 ES 군이 NC 군보다 유의적으로 낮았으며(p<0.05), BR5% 군은 NC 군보다 16.6% 낮았다. 혈청 NO는 블랙라즈베리를 섭취했을 때 농도 의존적으로 낮았지만, interleukin(IL) -1β, tumor necrosis factor-α(TNF-α), Interferon-γ(IFN-γ)는 검출되지 않았으며, 혈청 C-reactive protein 수준에는 변화가 없었다. 또한, 블랙라즈베리를 섭취한 군에서 혈청 IL-6, IL-10, IL-1α 수치가 농도의존적으로 낮았고, BR5% 군이 NC 군보다 낮았지만 유의적인 차이는 없었다. 조직의 염증성 유전자와 단백질 발현에 미치는 영향을 확인한 결과, 지방 조직에서 BR5% 군의 monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1) mRNA 발현량은 NC 군보다 81.8% 낮았고(p>0.05), BR5% 군의 IL-6 mRNA 발현량은 NC 군보다 유의적으로 낮았다(p<0.05). 지방 조직과 대동맥에서 iNOS 단백질의 발현은 BR2%와 BR5% 군이 NC 군보다 유의적으로 낮았으며(p<0.05), 간 조직에서의 NF-κB 단백질 발현은 BR2%와 BR5% 군이 NC 군보다 각각 48.1%와 66.3% 낮았다(p<0.05). 본 연구에서는 블랙라즈베리, 블랙베리, 복분자에 함유되어 있는 안토시아닌이 산화적 스트레스 상태에서 세포 내의 ROS와 DNA 산화를 억제시키는 것을 확인하였다. 또한 세 가지 나무딸기에 함유되어 있는 안토시아닌은 염증반응을 유발한 대식세포와 대장상피세포에서 NF-κB로부터 유도되는 염증성 단백질의 발현도 감소시키는 것을 확인했으나, 안토시아닌의 조성이나 종류에 따른 항산화와 항염증 활성의 차이는 나타나지 않았다. 블랙라즈베리에서 분리한 폴리페놀과 안토시아닌은 LPS로 유발한 염증 반응으로 인해 증가한 대식세포 내의 ROS와 DNA 손상도 억제했다. 동물 모델에서도 5%의 블랙라즈베리 동결건조물의 섭취가 난소절제로 인해 증가되는 혈청 산화지표를 완화시키며, 혈청 IL-6, IL-10, IL-1α 수치가 블랙라즈베리 동결건조물을 섭취한 군에서 농도 의존적으로 낮은 것을 확인했다. 또한, 5%의 블랙라즈베리 동결건조물의 섭취가 난소절제 동물의 지방 조직에서 유도되는 IL-6 mRNA 발현과 iNOS 단백질 발현을 완화하고, 간 조직에서의 NF-κB 단백질 발현도 완화한 것을 확인했다.