Novel Mutant Pendrin Detected from Patient with Enlarged Vestibular Aqueduct Shows Abnormal Activity of Anion Exchange Transporter

Abstract

서론: 와우도수확장증은 감각신경성 난청과 관련되어 가장 흔하게 발견되는 내이기형으로 종종 pendrin 단백질을 발현시키는 SLC26A4 유전자의 돌연변이와 연관되어 있다. Pendrin 단백질은 갑상선 여포세포, 내이의 비감각상피세포, 신장의 B형 개제세포의 세포막을 관통하여 위치하면서 Cl-와 I-을 HCO3-와 교환하는 역할을 한다. 와우도수확장증과 동반된 감각신경성 난청환자에서 갑상선종이 관찰되는 경우 Pendred 증후군이라 하고 갑상선종이 없는 경우 비증후군성와우도수확장증이라고 하며 두가지 모두 열성으로 유전된다. SLC26A4 유전자의 돌연변이로 인한 pendrin 변이의 세포내 수송기능 이상 및 음이온 교환장애가 가장 주된 병인론으로 알려져 있다. SLC26A4 유전자의 돌연변이는 과오돌연변이 (missense mutation), 골격변이 (frame shift), 접합위치변이 (splice site shift)의 형태로 나타나는데 대립유전자에서의 돌연변이개수와 표현형과 상관성에 대한 연구가 지속적으로 이루어지고 있다. 본 연구에서는 새로운 과오돌연변이의 병인성 잠재성에 대해 유전형 분석 및 기능적 분석을 통해 밝히고자 한다. 대상 및 연구 방법: 양측 난청으로 내원한 3세 여자 환자를 대상으로 시행한 청력검사상 양측 청력은 각각 66 dB HL, 75 dB HL이었고, 측두골 전산화 단층촬영상 와우도수관의 확장과 와우의 제2형 불완전 분할인 Mondini 기형이 양측에서 관찰되었다. 환자 및 부모의 genomic DNA를 추출하여 SLC26A4 유전자의 서열분석을 시행하였다. 정상 SLC26A4cDNA와 pEGFP-N1과 pGEM-HE를 이용하여 돌연변이를 유발시킨 후 COS-7 세포에 배양하여 pendrin 변이산물의 세포내 분포를 관찰하였다. 정상 pendrin과 변이 pendrin 산물을 HEK 293 세포에 발현하여 Cl-/HCO3-교환능을 측정하였다. 결과: 환자의 유전형 분석을 통해 이형 SLC26A4 유전자에서, 두 개의 돌연변이, p.H723R과 p.V510D를 발견하였다. 이 중 p.V510D는 새로이 발견된 변이로서 ortholog가 보존되고 paralog도 일부 보존된 것을 확인하였다. p.V510D pendrin 산물은 골지체에서 관찰되며 세포막으로의 수송이 저하되는 양상을 확인할 수 있었다. 또한, 정상 pendrin 산물에 비해 p.V510D pendrin 산물의 경우 음이온 교환능도 상대적으로 감소하는 양상을 보이는 것을 확인하였다. 결론: p.V510D 변이는 과오돌연변이로서 기존에 보고된 바 없는 새로운 변이형태로서 유전형 분석 및 기능적 분석을 통해 p.H723R과 유사하게 골지체에서 세포막으로의 수송에 관여하며 음이온 교환능과 연관되어 있음을 알 수 있다. 이러한 대립 유전자는 NSEVA의 돌연변이 대립유전자와 trans configuration에서 발병인자의 역할을 할 수 있을 것으로 사료된다.

Introduction: Mutations in the SLC26A4 gene encoding pendrin, a transmembrane exchanger, are a common cause of congenital hearing loss and is associated with enlargement of the vestibular aqueduct (EVA). Pendred syndrome (PDS) and nonsyndromic enlarged vestibular aqueduct (NSEVA, DFNB4) are clinical forms related with these mutations. It was reported that bi-allelic SLC26A4 mutations are associated with PDS whereas one or zero mutant alleles are associated with NSEVA. In cases of the bi-allelic SLC26A4 mutations with one known pathogenic mutant allele, evaluating the pathogenic potential of the newly detected SLC26A4 mutant allele could be important for clinical assessment and diagnostic and therapeutic approaches. This evaluation includes the genotypic and phenotypic context as well as functional characterization of the intracellular trafficking and anion exchange properties. In this study, we sought to define the pathogenic potential of the novel missense variant Material and methods: A 3 year-old girl with progressive sensorineural hearing loss and the parents were included in this study. Patient and parents underwent clinical, audiological, radiological and genetic evaluations. DNA sequencing of SLC26A4 gene was performed to identify genetic mutations. The protein processing and anion exchange activities were examined to evaluate the effects of mutations. DNA sequence analyses of SLC26A4were performed by polymerase chain reaction (PCR) amplification of 21 exons and splice sites. We characterized the ability of mutant pendrin products to traffic to the plasma membrane in COS-7 cells and to transport Cl-, and HCO3- in HEK 293 cells. Results: The pure tone average was 66dB HL in the right ear and 75 dB HL in the left ear, respectively. Temporal bone computed tomography showed enlarged vestibular aqueduct and Mondinis malformation bilaterally. By sequencing analysis, bi-allelic mutations were identified

one pathogenic variant (p.H723R), and one novel missense variant (p.V510D).The p.V510D pendrin product was shown to be entrapped in the ER, not trafficking to the plasma membrane in COS-7 cells. The p.V510D pendrin rate constants for Cl-/HCO3-exchange reduced, compared with those for wild-type pendrin Conclusion: The newly detected p.V510D is a novel missense variant, not described in literature. A trans configuration with pathogenic p.H723R, and impaired cellular trafficking and anion exchange property suggested the evidence of pathogenic potential of p.V510D.