High-throughput single-cell RT-qPCR in a volume-adjustable microwell Array

Abstract

단일세포 분석은 기존에 볼 수 없었던 생물학 및 의학 정보를 제공한다. 단일세포의 유전자 발현을 분석하기 위하여, 여러 가지 방법들이 개발되어 적용되었다: 역전사 PCR 정량분석 (RT-PCR), mRNA hybridization, RNA 시퀀싱 등이 있다. 이 중에서 RT-PCR이 특이성, 민감성 및 측정 범위에서 우수하기 때문에 많이 사용되었다. 최근 소형화 기술의 발달로, 작은 부피에서 반응을 진행할 수 있게 되어 대량 분석, 비용 절감, 민감성 증가 등을 가능하게 되었다. 이러한 기술은 단일세포 조작을 위한 마이크로플루이딕 부분과 함께 RT-qPCR 플랫폼에 적용되었다. 하지만, 아직 이러한 플랫폼들은 높은 제작 비용 및 분석량 제한 등의 단점이 있다. 이 논문에서는 부피 조절 가능한 미세우물 어레이를 이용한 단일세포 단위의 대량 역전사 PCR 분석 플랫폼을 제안하고 검증한다. 이 플랫폼은 25 μm 지름을 가지는 미세우물로 단일세포를 분리하고, 250 μm 지름의 미세우물로 세포 시체를 희석하고 PCR을 진행한다. 이 방법으로 80% 이상의 미세우물에서 단일 세포를 분리하였고, 오직 1% 미만의 미세우물에서만 여러 개의 세포가 발견되었다. 이는 기존의 포아송 분포에 의한 한계를 깨는 결과이다. 또한 이 플랫폼은 미세우물 구조를 사용하는 플랫폼에서 자주 발생하는 세포 시체에 의한 PCR 방해 현상을 극복하였다. 미세우물 칩에서의 형광을 매 싸이클마다 측정하여 단일 세포 단위의 유전자 발현 분석이 가능하였다. 더욱이, 이 플랫폼으로 2가지 유전자 발현을 측정하여 상대 정량을 하여 HL-60 단일 세포들에서 Myc 유전자 발현이 이형집단(bimodality)을 이룬다는 것을 확인하였다. 낮은 비용으로 많은 세포를 분석할 수 있는 이 플랫폼은 개인 맞춤형 의학을 위한 혁신적인 의학 및 생물학 연구에 기여할 것이다.

Single-cell analysis provides unprecedented information on biology and medicine. To analyze gene expression levels of individual cells, various methods have been developed and utilized: reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), mRNA hybridization, RNA sequencing. Among them, RT-PCR has been widely used for its specificity, sensitivity and dynamic range. Recent developments in miniaturized system have enabled high-throughput analysis, reduction of reagent cost, increase sensitivity in these gene quantification methods, by virtue of small reaction volume. Such techniques have been applied to RT-qPCR platforms with integration of microfluidic single-cell manipulation part. Yet, complex structures of these platforms requires high-cost fabrication and limited throughput. This thesis proposes and demonstrates volume-adjustable microwell-based single-cell RT-qPCR platform. In this platform, single-cells are isolated in microwells of 25 μm diameter, and diluted by assembly with microwells of 250 μm diameter, in order to minimize PCR inhibition by cell lysate. This way, more than 80% of microwells have single-cells while only less than 1% of microwells have multiple cells, overcoming the limitation by the Poisson distribution. Moreover, this platform is free from PCR inhibition by cell lysate, which has been a common inhibition factor in microwell-based PCR. Real-time measurement of fluorescent signal from this microwell PCR chip enables single-cell gene quantification. In addition, the platform reveals the bimodal Myc gene expression among single-cells in HL-60 cell line, by performing multiplex single-cell RT-qPCR. The author envisions that this low-cost, high-throughput platform will contribute to an innovative medical and biological research for personalized medicine.