Comparison of osteogenic effects of simvastatin on human periodontal ligament stem cells and bone marrow mesenchymal stem cells

Abstract

효과적인 항고지혈증 약물로 수십 년에 걸쳐 안전하게 사용되어 온 스타틴 또는 HMG-CoA 환원효소 억제제는 고지혈증 치료 외에 항혈전, 항산화, 항염증, 그리고 골형성 등 다양한 효과를 가진 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 심바스타틴이 사람 치주인대줄기세포와 골수줄기세포에 미치는 골형성 효과를 in vitro 와 in vivo 연구를 통해 비교해 보고, 치조골재생 치료제로서의 효과를 평가해 보았다. 치주인대줄기세포와 골수줄기세포 모두에서, 비록 MTT assay 상 심바스타틴 농도에 반비례하여 세포의 생존능이 감소하지만, 0.1 µM 이하 농도의 심바스타틴을 처리시엔 세포증식능이 유의하게 감소하지 않는 것을 세포수 측정을 통해 확인하였다. 치주인대줄기세포와 골수줄기세포 모두에서 심바스타틴 처리농도와 비례하여 지질분화가 억제되는 것을 유전자발현양상과 oil red O 염색으로 확인하였다. 알카리성 인산가수분해효소 단백질 활성은 0.01, 0.1 µM 농도 심바스타틴 처리시 치주인대줄기세포에서 골수줄기세포에 비해 유의적으로 높게 발현되었다. 그러나 골표지자 발현은 심바스타틴에 의해 유의한 영향을 받지 않았다. Alizarin red S 염색 결과 두 세포 모두 무기질침착은 0.1 µM 농도 이하에서 유사하였으며, 골수줄기세포에서 치주인대줄기세포에 비해 상대적으로 다량의 침착을 보였다. 조직염색 후 정량을 통해 쥐의 두개골 이식시 두 세포 모두에서 0.1 µM 농도에서 가장 골분화가 잘 일어났으며, 치주인대줄기세포에서 골수줄기세포보다 상대적으로 적으나 비견할만한 신생골이 형성되는 것을 확인하였다. 면역조직화학염색을 통해 골형성 표지자인 제1형 콜라겐과 osteocalcin 합성을 확인하였고, 이러한 신생골은 사람 골수줄기세포 및 치주인대줄기세포에 의해 만들어지는 것을 사람 미토콘드리아 항체를 통해 확인하였다. 결론적으로, 치주인대줄기세포의 골형성 촉진능은 골수줄기세포에 비해 적은 양의 골형성을 보이지만 심바스타틴을 적정량으로 처리한 결과 골수줄기세포에 비견할 만한 정도로 골형성이 촉진되는 양상을 보였다. 세포실험을 통해 적정 농도의 심바스타틴에 의한 치주인대줄기세포와 골수줄기세포에서의 골분화 촉진을 확인할 수 있었다. 또한 쥐의 두정골 이식결과 치주인대줄기세포는 골수줄기세포와 비견할 만큼 신생골 합성을 유도할 수 있음을 확인하였다. 그러므로 적정 농도의 심바스타틴은 치주인대줄기세포에 특이적인 골조직 재생 효과를 갖고 있어 치주 조직 재생에 유용한 치료제로서 사용할 수 있을 것으로 판단된다.

The statin 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) reductase inhibitor is an anti-hyperlipidemic agent that is used worldwide. It also has pleiotrophic effects associated with antithrombotic, antioxidant, anti-inflammatory, and bone anabolic actions. In this study, the osteogenic and anti-adipogenic effects of simvastatin on human periodontal ligament stem cells (PDLSCs) and bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) were investigated in vitro and in vivo. Direct cell counting and a 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay showed that proliferation of both cell types was not inhibited by treatment with 0.01 to 0.1 µM simvastatin, although viability of both cell types decreased in a dose dependent manner. Inhibition of adipogenic differentiation by simvastatin was highly dose dependent in both PDLSCs and BMMSCs according to reverse transcription polymerase chain reaction and oil red O staining. Osteogenic gene expressions were not changed by simvastatin treatment. However, PDLSCs showed more osteogenic activity than BMMSCs, as demonstrated by alkaline phosphatase activity in cells treated for 7 days with simvastatin. PDLSCs treated with 0.01 to 0.1 µM simvastatin showed increased mineralization at a level comparable to BMMSCs by alizarin red S staining. In this study, in vivo transplantation of mesenchymal stem cells pretreated with simvastatin revealed that most new bone formation was found after treatment with 0.1 µM of simvastatin, although BMMSCs showed relatively more new bone formation than PDLSCs. Immunohistochemical staining with antibodies against human mitochondria proved that the newly formed mineral matrix around the hydroxyapatite/tricalcium phosphate carrier was generated by human derived PDLSCs and BMMSCs. Mineralized tissue formations around grafted particles were also confirmed by immune-specific markers such as type I collagen and osteocalcin. We determined that in vitro stimulation of bone regeneration by simvastatin on human PDLSCs was comparable to that of BMMSCs. Calvarial transplantation demonstrated that PDLSCs treated with simvastatin increased mineralized tissue formation similar to BMMSCs. Simvastatin is a promising tool for PDLSCs specific periodontal regeneration.