Intracellular Delivery of Plasmid DNA and Antiviral Peptides Using Nanoparticles and Cell-Penetrating Peptides

Abstract

세포막을 통과하여 핵산, 펩타이드, 단백질들과 같은 생체고분자들을 전달하는 어려움은 새로운, 유력한 전달 전략들의 개발을 위한 필요성을 정당화한다. 특히, 지질과 고분자를 이용하여 세포안으로 핵산을 전달하는 현재의 비바이러스성 전략들은 제약 산업의 성공에 중대한 장벽을 나타낸다. 그러므로, 안전하고 효과적인 핵산 전달체의 개발이 빠르게 진행중이다. 칼슘인 기반 시스템이 고안할 수 있는 수많은 전달 전략들 중 한 신뢰할 수 있는 전달 시스템으로 간주한다. 그러나, 칼슘인 침전체들의 생리적 불안정성과 계속적인 성장이 생체시스템 내에서 효율적인 핵산 전달체로써의 적용을 제한한다. 이 장벽들을 극복하기 위하여, 나는 인산 기반 블록 공중합체 (PEG-b-PMOEP)를 합성하였고, 효율적이고 안전한 한 세포내의 유전자 전달체로써 블록 공중합체로 코팅된 칼슘인 나노파티클들을 구성하였다.PEG 블록이 칼슘인 침전체의 조절할 수 없는 성장을 막기 위하여 한 껍질을 형성하는 동안, PMOEP 블록은 칼슘인 속으로 삽입되어질 수 있다. 칼슘인 나노파티클들은 생리적 pH 7.4에서 봉입된 pDNA를 방출하지 않았으나, 엔도좀 pH 5.0에서는 인산 형태의 pH 의존적 양성자화를 통하여 pDNA를 방출하였다. PEG-b-PMOEP/CaP/pDNA 나노파티클들은 미래의 유전자 치료제 적용을 위한 유전자 전달체로서 큰 잠재성을 나타낸다. 한 비바이러스성 전달체로써 세포투과성 펩타이드 (CPPs)의 사용은 CPPs가 높은 세포 투과력을 성취하기 위해 필수적인 마이크로몰내의 CPPs의 농도를 필요로 한다. 그러나, 현재의 기술들은 단 시간내에 펩타이드의 불완전한 투과와 세포 내에서 마이크로몰 농도의 펩타이드의 장시간 노출 때문에 세포막 손상과 같은 다양한 부작용과 연관되어 있다. 그러므로, 나는 나노몰 농도에서 CPPs의 적용을 위해 류신과 라이신으로 이루어진 단량체 LK-1과 LK-2 뿐만 아니라 펩타이드 스테이플링 기술을 사용하여 LK-3와 LK-4로 이름지어진 이량체 알파나선형 세포투과 펩타이드를 구성하였다. 환원성의 이황화 결합 혹은 비환원성 결합을 사용한 이량화 전략은 수용액에서도 높은 알파나선형 성질을 초래하였다. 특히, 펩타이드의 알파나선형과 세포투과성 사이의 강한 관련성을 본 연구에서 관찰하였다. 소위, 류신과 라이신으로 이루어진 LK 펩타이드들은 이전 논문에서 HIV-1의 TAR RNA에 대하여 강한 결합 친화성을 보였다. HIV-1의 TAR RNA는 바이러스성 Tat과 결합함에 의해 전사 활성화에 참여한다. LK 이량체들은 포유 세포들에서 효율적인 세포 투과와 Tat-TAR 상호작용의 저해를 위해 낮은 나노몰 수준에서 독성을 가지지 않은 채 세포막을 투과할 수 있다. T-림프아구성 세포들에서 HIV-1 복제의 효과적인 저해는 LK 이량체들, 특히 LK-3가 항바이러스성 펩타이드로서의 강한 잠재성을 지님을 제안한다.

The difficulty in delivering biomacromolecules such as nucleic acids, peptides, and proteins into cells through the cellular membranes warrants the need for the development of novel, potent delivery strategies. In particular, current non-viral strategies for delivering nucleic acids into cells using lipids and polymers present a significant hurdle to the success in pharmaceutical industry. Therefore, the development of safe and efficient nucleic acid delivery carriers has been proceeding rapidly. The CaP-based system is regarded as a reliable delivery system among the numerous delivery strategies being devised. However, the physiological instability and uncontrolled growth of CaP precipitates limit their application as efficient nucleic acid delivery carriers in biosystems. To overcome these barriers, I have synthesized a phosphate-based block copolymer, PEG-b-PMOEP (poly(ethylene glycol)-b-poly(2-methacryloyloxyethyl phosphate)), and have constructed calcium phosphate nanoparticles (CaPNs) coated with the block copolymer as an efficient and safe intracellular gene delivery carrier. While PEG block forms a shell to prevent uncontrolled growth of CaP precipitates, PMOEP block could be inserted into the calcium phosphate (CaP) core to entrap pDNA. The CaPNs showed no release of entrapped pDNA at physiological pH 7.4, but released pDNA at an endosomal pH 5.0 through a pH-dependent protonation of phosphate moieties. The PEG-b-PMOEP/CaP/pDNA nanoparticles exhibited great potential as gene delivery vehicles for future gene therapy applications. The use of cell-penetrating peptides (CPPs) as a non-viral delivery vehicle requires the concentration of CPPs in the micromolar range, which is essential for CPPs to achieve a high cell-penetration ability. However, current technologies are associated with various disadvantages such as incomplete penetration of the peptides within a short time period and cell membrane damage due to the long-term exposure to the micromolar peptides. Therefore, I constructed monomeric LK-1 and LK-2 peptides, as well as dimeric alpha-helical cell-penetrating peptides (DHCPPs), named as LK-3 and LK-4, consisting of leucines (L) and lysines (K), by using a peptide stapling technique to enable the use of CPPs in the nanomolar range. The dimerization strategy based on a reducible disulfide bond or a non-reducible bond resulted in the high alpha-helical propensities of the peptides even in aqueous media. In particular, a strong correlation between alpha-helicity and cell-penetrating ability of the peptides was identified in the study. The LK peptides exhibited a strong binding affinity for the transactivation response element (TAR) RNA of human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), as reported in the previous study. The TAR RNA of HIV-1 participates in the transcriptional elongation by interacting with the viral Tat protein. The LK dimers are able to efficiently penetrate the cell membrane for inhibiting the Tat-TAR interaction in mammalian cells without showing toxicity in the low concentration (i.e., nanomolar) range. The effective inhibition of HIV-1 replication in T-lymphoblastoid cells strongly suggests that the LK dimers have exhibited great potentials for use as antiviral peptides.