In Vitro Inhibitory Effect by Korean Intestinal Microbial Isolates on Clostridium difficile

Abstract

Clostridium difficile 감염 (이하 CDI

Clostridium difficile infection)은 대표적인 원내감염의 하나로써, 항생제 사용으로 인한 장내 정상 세균총의 불균형과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 어떤 종의 세균이 그러한 역할을 하는지, 혹은 어떠한 기전으로 CDI에 대한 저항성이 발현되는지에 대해서는 아직까지 연구되어야 할 부분이 많다. 밝혀진 바에 의하면 세균에 의한 대사물질이 CDI 저항성을 매개하는 사례들이 있다. Taurocholate를 비롯한 일차담즙은 C. difficile 포자의 발아를 촉진하는 역할을 하는 반면, 장내 세균의 효소에 의해 대사되어 생성되는 이차담즙은 C. difficile 균의 성장 및 포자의 발아를 저해한다. 또한 butyrate를 비롯한 단쇄지방산은 장내 염증 완화 효과를 가지는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 한국인에게서 분리한 세균 중 담즙산의 대사하는 균과 단쇄지방산을 생성하는 균을 대상으로 C. difficile의 성장 저해 및 C. difficile의 독소로 인한 세포독성의 완화 효과가 있는지 알아보았다. 담즙을 대사하는 것으로 알려진 Clostridium scindens, Lactobacillus, Bacteroides는 중 담즙을 대사함으로 보다 강한 저해를 나타내는 것으로 추정되는 분리균주가 있었다. 단쇄지방산을 생성하는 세균의 상층액을 이용한 실험에서 세포독성의 저하는 관찰되지 않았으며, butyrate를 단독으로 사용한 실험에서도 마찬가지로 세포독성에 있어 변화는 관찰되지 않았다. 본 실험의 결과를 통해 담즙의 대사 능력이 C. difficile의 저해 균주 선발에 있어서 중요한 요소임을 재확인 할 수 있었다.

Clostridium difficile infection (CDI), one of the major healthcare-associated infections (HAIs), is associated strongly with the administration of antibiotics, causing alteration of intestinal microbiota. Nevertheless, mechanistic understand and key species resist colonization of C. difficile are still to be elucidated. Several studies reported that the relationship between microbial metabolites and CDI resistance. Secondary bile acids, entirely produced by microbial metabolism, were previously reported as inhibitor of germination and vegetative cell growth of C. difficile, whereas primary bile acids, particularly taurocholic acid (TA) derivatives, were commonly used as germinant to culture C. difficile in laboratory since 1974. Short chain fatty acids (SCFAs), especially butyrate, have been thought to be important due to their beneficial features, such as anti-inflammatory effect. In this paper, some of Korean intestinal isolates were evaluated their inhibitory activity in vitro. First, inhibitory effects on C. difficile vegetative cell growth were determined. The neutralized bacterial supernatants were added to C. difficile culture media, and the growths were measured by optical density. For known bile acid metabolizing bacteria, bile mixture was added in bacterial culture media to assess influence of bile acid metabolizing ability to inhibitory effect. Second, the preventive effects of supernatants were assessed via cytotoxicity test. Human colon cell line Caco2 and HT-29 were challenged with the toxic-containing C. difficile culture supernatant, with the commensal bacterial supernatants. Briefly, among tested bacteria isolates, isolates of Lactobacillus shows biggest reduction of C. difficile growth without bile acid. However, these results were reversed when they cultured with bile mixture, except L. plantarum. C. scindens showed inhibitory effects, especially when they were cultured with bile acid mixture. Although differences between species and strain were existed, Bacteroides caccae isolates were not effective, but B. ovatus isolates showed effectiveness when they were cultured in bile mixture containing medium. The butyrate-producing bacteria, F. prausnitzii and R. intestinalis did not show significant growth inhibition or cytotoxicity resistance. These results imply that commensal bacteria could prevent or promote C. difficile growth, depend on their bile acid metabolizing ability.