Utilizing extract obtained from leaves of Sasa borealis as anti-microbial agent and analysis of alteration in the fecal microbiome via pyrosequencing in ICR mice

Abstract

사람들은 항상 세균에 노출되어 있다. 흔한 감기나 염증에서부터 목숨을 앗아 갈수 있는 질병까지, 세균이 인간에게 미치는 영향은 실로 엄청나다. 이에 사람들은 세균에 대항하는 물질, 즉 항생제를 끊임없이 연구하고 제조해 왔다. 하지만 사람들의 계속된 복용으로 인해 대다수의 항생제에 대한 내성이 점차 생겨나고 있다. 쉽게 말하자면, 세균들도 인간들의 공격에 대해 그 나름의 방식으로 대응, 변화한 것이다. 항생제는 주로 세균 세포의 세포벽 합성 혹은 단백질 합성을 억제하거나, 세포막의 투과성을 변동시키거나, 세균의 물질대사를 억제시키는 등의 기작으로 세균 세포를 사멸시킨다. 하지만 항생제의 오남용 혹은 지나친 복용으로 인해 내성이 생기는 경우가 있다. 내성균이 한번 생겨나면 그 내성균은 다른 균에도 내성을 전이시켜 내성균이 계속 늘어나게 하기 때문에 결국에는 항균 능력이 더 강한 항생제 혹은 다른 계열의 항생제로 바꾸어 사용해야 한다. 그렇기에 병원성 세균들이 내성을 가지지 않는 새로운 항생 물질을 발견하는 것은 매우 중요하다. 이에 본 연구에서는 대나무 Sasa borealis종의 잎에서 항균 작용을 하는 물질을 발견하고, 대나무 잎의 항균 활성을 알아보았다. 또한 분변에서 추출한 bacterial 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석을 통한 intestinal microbiome 분포의 변화를 분석하였다. 대나무는 전 세계적으로 92개의 속과 1400여 종이 존재한다. 우리나라에도 4속 14종의 대나무가 자라고 있다. 이 중 왕대, 오죽, 조릿대 (Sasa borealis) 등 몇 가지 종만이 사람들에게 알려져 있다. 가장 흔하게 볼 수 있는 대나무는 조릿대인데, 성인병에 효능이 있다고 알려져 있기는 하지만 그러한 사실에 대한 의학적 연구는 아직 진행이 미미한 상태이다. 한방에서도 대나무가 약으로 쓰여 온 경우는 있지만, 그 잎을 약재로 쓰지는 않았다. 본 실험에서는 조릿대 (Sasa borealis)를 재료로 사용하는데, 구매한 조릿대 잎은 잘 말려서 잘게 썰어 놓은 것으로 항균 물질을 추출하기에 적합하였다. 댓잎 추출물을 농축하지 않은 채로 여러 종류의 미생물 (20가지 bacteria) 들에 처리하여 억제환 생성을 살펴보았더니, 그 중 대다수에 대하여 성장 억제 효과를 보였다. 반면, 전혀 영향을 받지 않는 몇몇 미생물들이 있다는 것을 볼 수 있었는데, 알고 보니 이들은 모두 유산균 (Lactic Acid Bacteria)에 해당하는 것이었다. 어떤 경우에라도 유산균들이 억제되지 아니하고 다른 불필요한 미생물들의 성장만 억제된다면, 이와 같은 물질을 유산균의 효능을 극대화 시키는 등의 용도에 활용할 수 있을 것이라 판단하였다. 유효성분만을 분리해 내기 위하여 앞에서 이야기한 것처럼 새로운 방법을 도입하여, 추출물에 황산암모니움 (Ammonium Sulfate)을 첨가하여 유효 성분을 침전시켰다. 상등액을 따로 분리해 놓고, 침전물은 황산암모니움 (Ammonium Sulfate)을 제거한 다음 다시 항균 효과를 점검하였다. 이때, 원액에 의하여 억제되던 미생물 가운데 몇 종류의 미생물들이 정제한 성분에 대하여 효과가 나타나지 아니하였다. 이것은 두 가지로 생각해 볼 수 있다. 우선은, 황산암모니움 (Ammonium Sulfate)으로 침전시키는 과정에서 약간의 분자 변형이 일어났는데, 이 변형으로 인하여 특정 미생물에 대해서는 항균효과를 보이지 않았을 수도 있다. 아니면, 이 미생물을 억제하기 위해서는 황산암모니움 (Ammonium Sulfate)으로 침전되지 않는 다른 성분이 필요할 수도 있을 것이다. 그래서 본 연구에서는 침전된 성분과 침전되지 않은 성분을 섞어 다시 항균 효과를 조사하였다. 이 과정에서 여전히 효과를 보이지 않은 미생물들도 존재하였으나, 두 가지 미생물들이 성장 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 이들은 Bacillus subtilis와 Serratia marcescens였다. 이들 미생물에게는 두 가지 이상의 성분이 작용하여야만 성장이 억제될 수 있음을 의미하는 것이다. 그런데, 두 가지 성분을 섞어 주었음에도 불구하고 여전히 성장 억제 효과가 되살아나지 않은 미생물들은 결과적으로 또 다른 성분이 필요한 것이거나, 정제과정에서 항균물질이 어떤 이유로든 억제 효과를 잃어버리고 만 것이라고 밖에 생각할 수 없다. 앞선 결과를 통해, 부분적으로 정제한 댓잎의 항균 물질이 당을 포함하는 당단백질 (Glycoprotein)일 것이라는 것을 알게 되었고, Acrylamide gel을 통한 분자량을 조사한 결과, 100kDa정도 크기의 Bacteriocin에 해당하는 물질을 찾았다고 잠정적으로 생각하게 되었다. 세균뿐만 아니라, 댓잎 추출물이 암세포나 육종 세포등 다양한 세포에는 어떤 영향을 끼치는지도 본 연구를 통해 알아보았다. 그 결과, normal cell에 해당하는 murine splenocyte나 macrophage cell line들에는 cytotoxicity를 보이지 않았고 murine colon cancer cell line인 CT-26 cell line과 murine sarcoma cell line인 S-180 cell line 그리고 murine T-lymphoblast cell line인 EL-4 cell line은 세포의 성장이 억제되었다. 분변에서 추출한 bacterial 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석을 통한 intestinal microbiome 분포의 변화를 관찰, 분석한 결과, STD나 HFD만 제공한 그룹에 비해 댓잎 추출물과 유산균을 함께 경구 투여한 그룹에서 sequence수가 더 많았다. HFD만을 제공받은 그룹은 STD를 제공받은 그룹에 비해 fecal microbiome에서 Bacteroidetes의 수는 감소하였고 Firmicutes의 수는 증가하였다. 반면, 댓잎 추출물과 유산균을 경구 투여한 그룹은 HFD만 제공받은 그룹에 비해 Bacteroidetes는 크게 증가하였으며 Firmicutes는 감소하였다. 따라서 HFD만 제공받은 그룹은 fecal microbiome에서 Bacteroidetes에 대한 Firmicutes의 비율이 가장 높았고, 댓잎 추출물과 유산균을 함께 투여한 세 그룹의 비율은 STD만 먹인 그룹보다도 낮았으며, 댓잎 추출물과Lactobacillus paraplantarum GL을 경구 투여한 그룹에서 가장 두드러졌다. HFD에 의해 유도된 비만의 결과, 장내 세균총 중 Bacteroidetes는 감소하고 Fermicutes는 증가한다고 밝혀져 있는데 (Ley RE et al, 2006), 불필요한 미생물을 사멸하고 유산균은 살리는 selectivity를 가진 댓잎 추출물과 probiotic로 알려진 유산균은 비만에 의한 fecal microbiome 분포의 변화를 정상상태로 회복시킨다는 사실을 확인하였다.

Bacteria are a large domain of prokaryotic microorganisms with a typical length in micrometers. Bacteria have a wide range of shapes, ranging from spheres to rods and spirals. There are in the region of ten times as many bacterial cells in the human flora as there are human cells in the body, with large numbers of bacteria on the skin and as gut flora (Sears CL, 2005). Most of the bacteria in human body are considered harmless by the protective effect of the immune system, and some even are thought to be beneficial. However, few species of bacteria display harmful effect to human being meaning it causing a disease. These are called pathogenic bacteria. Presence of pathogenic bacteria brings out the necessity of any substance that kills or slows down the growth of pathogenic bacteria

that is antibiotics. Antibiotics display several ways in killing bacteria. At first, quinolone antibiotics interfere with changes in DNA supercoiling by binding to topoisomerase II or topoisomerase IV. This leads to the formation of double-stranded DNA breaks and cell death in either a protein synthesis-dependent or protein synthesis-independent manner. β-lactams inhibit transpeptidation by binding to penicillin-binding proteins (PBPs) on maturing peptidoglycan strands. The decrease in peptidoglycan synthesis and increase in autolysin leads to lysis which kills the cell. Lastly, aminoglycosides bind to the small (30S) subunit of the ribosome and case misincorporation of amino acids into elongating peptides. Mistranslated proteins cause misfolding and it can lead to increased drug uptake (Kohanski et al., 2010). However, number of pathogenic bacteria has evolved mechanisms to overcome these antibiotic-induced cell deaths. These mechanisms are able to either chemically modify the antibiotics or modify target sites so that it is not recognized by certain antibiotics. Due to these reasons, it is important to develop newly advanced antibiotics that can cause antibiotic-induced cell death. In this study, anti-microbial activity of extract obtained from leaves of Sasa borealis was investigated. Bamboo (Sasa borealis) Leaf Extract (BLE) was tested out against numerous bacteria including Gram (+), Gram (-) and also Lactic Acid Bacteria (LAB). Without any concentration process, BLE showed strong inhibiting ability against both Gram (+) and Gram (-) bacteria. Lactic acid bacteria are considered a probiotic species and were not inhibited by BLE. With this data, it was clear that extract obtained from leaves of Sasa borealis contains certain type of substance or molecule with strong antibiotic effect. For further research, ammonium sulfate precipitation was performed and using an acrylamide gel electrophoresis, substance with size of near 100kDa was discovered and thought to be bacteriocin secreted by Sasa borealis. In a similar manner, bamboo leaf extract was tested to perceive if there are any cytotoxic effects against several cell lines. At first, BLE was tested against normal cells (murine splenocyte, RAW264.7, J774) and as a result, it did not show any cytotoxic effect. However, BLE showed solid cytotoxic effect against murine colon cancer cell line (CT-26), murine sarcoma cell line (S-180) and murine T-lymphoblast (EL4). Bacterial 16S rRNA gene was analyzed via technique called pyrosequencing in order to explore intestinal microbial community in fecal sample of experimental mice. Most fecal bacteria belonged to two major bacterial phyla

that are Bacteroidetes and Firmicutes. Comparing HFD-treated group (Group 2) and BLE+LAB (Lactobacillus casei LS2, Lactobacillus paraplantarum GL and Leuconostoc citreum IH22) administered groups (Groups 3, 4, 5), there were quite significant difference in proportion of phyla Bacteroidetes and Firmicutes. Despite the fact that BLE+LAB administered groups had as low Bacteroidetes to Firmicutes ratios as STD-treated group, HFD treated group which became progressively obese had Firmicutes enriched microbiome. Accordingly, it was clear that selectivity of BLE and LAB attributed to restoration of altered fecal microbiome.