백서 심실근세포에서 안지오텐신 II에 의한 NOS1의 활성화 및 이완촉진 기전에 대한 연구

Abstract

레닌 안지오텐신 시스템은 정상적인 심혈관에 강력한 수축작용을 일으킬 뿐만 아니라 고혈압, 심장비대, 심부전, 부정맥과 같은 심혈관계 질환에서도 중요한 역할을 수행한다. 심장에서 안지오텐신 II (Angiotensin II)는 산화적 스트레스나 G 단백질 의존적 신호전달 경로를 통하여 심장비대나 심부전과 같은 질병을 발생시킨다. 최근연구에 의하면 신경성 Nitric Oxide 합성효소(NOS1 혹은 nNOS)는 정상 심장에서 심근 이완을 촉진시킴으로서 심장 확장기 기능을 활성화시킨다. 특히, 심근비대나 심부전과 같은 질환의 심장 조직에서 NOS1 단백질의 발현 및 활성화 증가는 산화적 스트레스 및 심장질환 악화에 대항하는 중요한 방어 기전으로서 작용하고 있다. 하지만 아직까지 심장에서 특이적으로 NOS1을 조절하는 기전에 대해서는 알려진 바 없다. 본 연구에서는 백서의 좌심실근세포에서 안지오텐신 II에 의한 NOS1의 발현과 활성화에 의한 조절 및 수축성을 관찰하고 그 기전을 밝히고자 한다. 안지오텐신 II가 NOS1에 미치는 영향을 확인하기 위하여 안지오텐신 II (1 μM)를 시간에 따라 처리하고(30분∼6시간), 좌심실 근세포에서 NOS1 mRNA, 단백질 발현을 관찰하였다. 3시간을 처리한 좌심실 근세포에서 NOS1의 mRNA와 단백질 발현이 증가함을 관찰할 수 있었다. 발현뿐만 아니라 NOS1 활성화(NO 생성)도 증가 되었다. NO 생성에 있어서 중요한 수용체인 안지오텐신 II 제 2형 수용체(AT2R)의 길항제인 PD123319를 전 처리 한 경우 NOS1 단백질 발현 및 NO 생성이 차단됨을 볼 수 있었다. 또한 AT2R의 선택적 효현제인 CGP42112A (1 μM, 3시간)는 안지오텐신 II와 동일하게 NOS1 단백질의 발현을 증가시켰다. 따라서 안지오텐신 II에 의한 NOS1 증가에 있어서 AT2R이 필수적임을 알 수 있었다. 하지만 안지오텐신 II 제 1형 수용체(AT1R)인 Losartan을 전 처리 한 경우에도 안지오텐신 II에 의한 NOS1 단백질 발현과 NO 생성이 증가하지 않았다. 안지오텐신 II는 AT1R을 활성화시켜 NADPH 산화효소 의존적 ROS를 증가시킨다. NADPH 산화효소 억제제(Apocynin), ROS scavenger (4,5-dihydroxy-1,3-benzenedisulfonic acid, Tiron), 환원제(Dithiothreitol, DTT)를 사용하여 ROS 생성을 억제한 경우에도 안지오텐신 II에 의한 NOS1 단백질 발현 및 NO 생성이 차단된 것으로 나타났다. 따라서 AT1R 활성화로 인한 NADPH 산화효소 의존적 ROS 생성이 안지오텐신 II에 의한 NOS1 조절기전의 주요한 상위 조절자로서 작용함을 알 수 있었다. AT1R의 활성화와 AT2R 사이의 관계를 밝히기 위하여 안지오텐신 II 처리 전 후 AT1R과 AT2R의 세포막 발현 단백질을 각각 확인하여 보았다. 안지오텐신 II 처리 전에는 세포막에 발현된 단백질의 양이 AT1R에 비해 AT2R이 매우 낮았다. 하지만 안지오텐신 II 처리 후 30분에 AT1R의 세포막 단백질 발현은 감소하였고, AT2R의 세포막 단백질 발현은 증가함을 확인할 수 있었다. 흥미롭게도 AT2R의 세포막 단백질 발현은 Losartan, Apocynin, Tiron의 전 처리에 의하여 차단되었다. 따라서 AT1R을 통한 ROS 생성이 AT2R을 세포막으로 이동시켰음을 확인할 수 있었고, 이러한 결과는 AT1R-NADPH 산화효소 의존적 ROS 생성을 통한 AT2R의 세포막으로 이동 증가가 안지오텐신 II에 의한 NOS1의 조절 기전으로서 작용할 수 있음을 시사한다. 다음으로, 심근세포 내 생성된 NOS1의 작용을 살펴보기 위하여 안지오텐신 II 처리 후 NOS1이 ROS 생성에 미치는 영향을 살펴보았다. 잘 알려져 있듯이, 심근세포에 안지오텐신 II를 30분 처리하였더니 ROS가 증가한 사실을 확인할 수 있었다. 하지만 처리 후 3시간에는 ROS가 오히려 감소하였다. 놀랍게도, NOS1의 선택적 억제제인 SMTC (S-methyl-L-Thiocitrulline)는 감소된 ROS를 다시 증가시켰다. NADPH 산화효소 활성화에 따른 초과산화물(superoxide)측정에서도 같은 결과를 얻었다. 따라서 안지오텐신 II에 의하여 증가된 NOS1은 NADPH 산화효소 활성화를 억제한다는 새로운 사실을 알 수 있었다. 활성화된 NOS1이 심장 수축에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 좌심실 근세포의 이완 시간(TR50)을 측정한 결과, 안지오텐신 II 처리 후(3시간) 심근 이완이 촉진됨을 확인할 수 있었고, 이는 SMTC, Losartan, PD123319, Apocynin, Tiron 전 처리에 의하여 모두 사라졌다. Phospholamban의 인산화(PLN-Ser16)는 NOS1의 심장 이완 촉진 기전으로서 알려져 있다. 예상과 같이 안지오텐신 II 처리 후 PLN-Ser16이 증가 되었고 SMTC는 이를 억제하였다. 따라서 안지오텐신 II에 의한 NOS1 생성이 PLN의 인산화를 통하여 심근세포의 이완을 촉진시킴을 알 수 있었다. Protein kinase A (PKA) 억제제(PKI 14-22 amid)에 의해 안지오텐신 II에 의한 PLN-Ser16의 증가는 억제되지 않았으나 soluble guanylate cyclase (sGC)의 억제제인 ODQ (1H-〔1,2,4〕oxadiazolo〔4, 3-a〕quinoxalin-1-one)와 PKG 억제제인 KT5823은 모두 PLN-Ser16의 증가를 억제하였다. 이상의 결과를 종합해 볼 때, 백서 좌심실근세포에서 안지오텐신 II는 NOS1의 mRNA와 단백질 및 NO의 활성화를 증가시켰고, 이 효과는 AT1R과 AT2R에 의하여 매개된다. 흥미롭게도 안지오텐신 II에 의한 AT2R의 세포막 이동은 AT1R과 ROS 의존적이며 이는 AT2R 활성화를 통한 NOS1 증가의 상위기전으로 예상된다. 또한 증가한 NOS1은 NADPH 산화효소를 억제함과 동시에 sGC/PKG에 의한 PLN 인산화를 통하여 심근 이완을 촉진시켰음을 알 수 있었다.