The generation of semi-mature dendritic cells by inhibiting acetyl-CoA carboxylases

Abstract

연구배경: 준성숙 (semi-mature) 또는 미성숙 (immature) 단계의 수지상 세포는 항원-특이적 T 세포 면역관용을 유도할 수 있다고 알려져 있다. 면역관용 유도능이 있는 이러한 수지상 세포 (Dendritic cell)을 이용하여 이식거부반응의 억제나 자가면역질환 등의 치료에 응용하려는 연구들이 많이 시도되고 있다. 본 연구는 지방 대사과정 중 지방산 (fatty acid)의 합성 (synthesis)과 산화 (oxidation)에 중요한 역할을 하는 acetyl-CoA carboxylase (ACC)가 수지상세포의 성숙과정에 미치는 영향에 대해 알아보았다. 또한 acetyl-CoA carboxylase 가 억제된 상황에서 생성된 준성숙 수지상세포가 시험관내에서 (in vitro) 항원특이적 T 세포의 증식과 활성에 미치는 영향에 대하여 알아 보았다. 재료 및 방법: 8주령의 C57BL/6 마우스 골수에서 분리한 골수세포를 GM-CSF (10 ng/ml)와 IL-4 (1.5 ng/ml)가 포함된RPMI 배지에서 8일간 배양 및 분화시켜 골수유래 미성숙 수지상세포를 획득하였다. 8일간 배양된 골수유래 미성숙 수지상세포는 24 시간동안LPS (Lipopolysaccharide) 자극을 줌으로서 성숙 수지상세포로의 분화를 유도하였다. Acetyl-CoA Carboxylase의 활성을 저해하기 위해 CP-640186 이라는 Acetyl-CoA Carboxylase 활성 저해제를 사용하였다. 그 후 미성숙수지상세포, 성숙 수지상세포 그리고 acetyl-CoA carboxylase의 억제 화합물인 CP-640186를 처리한 수지상세포의 세포표면인자 발현량, 사이토카인 분비능, 항원섭취능력 (antigen-uptake capacity), 항원특이적 T 세포 증식능력등을 비교하였다. 결 과: 미성숙수지상세포에서는 LPS의 자극에 의해 성숙수지상세포로 변화되는 과정에서 지방산의 합성이 증가되었다. 이에 반해 지방산 합성과 산화에 관여하는 acetyl-CoA carboxylase가 저해된 수지상세포에서는 성숙수지상세포에 비해 지방산 합성이 현저히 감소되었다. Acetyl-CoA carboxylase 저해제를 사용한 수지상 세포는 성숙 수지상세포에 비해 MHC-class II 와 보조자극분자 (co-stimulatory molecule)인 CD80, CD86, CD40의 발현량이 감소되었다. 동시에 염증성 사이토카인인 IL-6, IFN-γ, IL12p70의 발현 또한 CP-640186의 사용량에 비례하여 억제되었다. 흥미롭게도 케모카인 수용체 (chemokine receptors) 중, lymph node 귀소 수용체 (homing receptor)인 CCR7의 세포표면 발현은 acetyl-CoA carboxylase사용에 의해 감소되었지만 CCR5의 발현은 오히려 증가되었다. Acetyl-CoA carboxylase의 억제에 의해 수지상세포의 항원섭취능은 증가되었다. 따라서 acetyl-CoA carboxylase의 억제에 의해 미성숙 수지상 세포는 성숙과정에서 준성숙 수지상세포로 변화되었음이 세포표면인자, 항원 섭취능력 및 염증성 사이토카인의 발현량등을 통해 확인되었다. 이렇게 만들어진 준성숙 수지상세포는 성숙 수지상세포에 비해ovalbumin-specific CD4+T 세포의 증식을 항원특이적으로 저해 하였다. 결론: 지방산의 합성과 산화에 중요한 acetyl-CoA carboxylase를 저해함으로써 준성숙 수지상세포를 만들수 있음을 이 실험을 통해 밝혔다. 이러한 방법을 통하여 얻어진 준성숙 수지상세포는 수지상세포를 응용한 면역치료에 응용될 수 있을 것이다.

Introduction: The adoptive transfer of tolerogenic dendritic cells has been employed as a promising tool for transplantation as well as treatment of autoimmune diseases. Some different tolerogenic dendritic cells share the feature of semi-mature state. Also current studies have demonstrated that fatty-acid synthesis is important for dendritic cell activation while fatty-acid oxidation is necessary for maintaining immature state. Therefore, in this study, I focused on blocking acetyl-coA carboxylases which can inhibit fatty-acid synthesis and promote fatty-acid oxidation to generate the semi-mature dendritic cells which may have potential for immunotherapy. Methods: Bone marrow cells (BMs) were isolated from 8-week-old C57BL/6 female mice then have been cultured for 8 days (in RPMI complete media with 10 ng/ml GM-CSF and 1.5 ng/ml IL-4) to differentiate to dendritic cells (DCs). At day 8, bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs) were pre-incubated for 30 minutes with CP-640186 (CP), an acetyl-CoA carboxylase (ACC) inhibitor, following by LPS treatment up to 24hours for maturation. BMDCs and BMDCs with LPS treatment only were used as control groups. The effect of CP on BMDC maturation was investigated through DCs phenotypic and functional studies. Results: The effect of CP to block ACCs in DCs was confirmed. Next, the expression of MHC class II and co-stimulatory molecules (CD80, CD86 and CD40) on LPS-treated BMDCs were down-regulated by CP with concentration dependent manner. Consistently, the secretion of pro-inflammatory cytokines (IL-6, IFN-γ, IL-12p70) also decreased. Interestingly, the chemokine receptor, CCR5 was up-regulated while the homing receptor, CCR7 was down-regulated in CP treatment groups. Moreover, these groups also increased antigen uptake capacity. Finally, in the presence of CP, LPS-treated BMDCs failed to activate antigen-specific CD4+T cells proliferation. Conclusions: In summary, our data elucidates that DCs with semi-mature phenotype and characteristic of immature-like cells were generated by ACCs inhibition. This study has implication for the development of metabolism based-approaches in DC-mediated immunotherapies.