TM4SF5 C말단을 포함하는 세포막 투과성 펩타이드의 c-Src 활성화 의존적 암화 기능 억제 연구

Abstract

Transmembrane 4 L6 family member 5 (TM4SF5) 는 tetraspanin superfamily 에 속하는 막 단백질로서, 세포막을 네 번 통과하는 구조를 가진 당단백질이다. TM4SF5는 간암을 포함한 다양한 암종에서 높게 발현되며, EMT (epithelial-mesenchymal transition, 상피-중배엽 세포 전이)를 유발함으로써 세포의 형태 변화뿐 아니라 이동과 침윤, 증식을 촉진하는 역할을 하고 있음이 밝혀졌다. 한편, c-Src는 세포 내에서 다양한 역할을 수행하는 신호 전달 인자로서, 선행 연구를 통해 TM4SF5의 C-말단과 결합하여 TM4SF5에 의해 매개 되는 세포의 침윤을 조절한다는 것이 밝혀졌다. 이에 본 연구는 TM4SF5와 c-Src 와의 결합에 의한 자세한 분자적 수준의 c-Src 활성화 메커니즘과 그것을 억제할 수 있는 세포막 투과성 펩타이드를 개발함으로써 그것의 항암제 효과를 발견하였다. TM4SF5 를 발현하지 않거나 발현하는 SNU449 및 SNU761 간암 세포주를 이용하여 c-Src 의 다양한 construct 와의 면역 침강 실험을 통해 c-Src의 kinase 도메인 (250-536 amino acids, SH1 domain)이 TM4SF5 에 특이적으로 결합한다는 것을 확인하였다. 더욱이, SH1Y419F 이 SH1 의 wild-type 보다 TM4SF5 와 더 잘 결합하며, SH1Y530F 와는 결합하지 않았다. 이러한 결과는 SH321, SH321Y419F, SH321Y530F construct 를 이용한 면역 침강 실험 결과에서도 동일하게 확인할 수 있었으며, 더불어 c-Src 의 타이로신 530번을 탈인산화시키는 단백질인 PTP1B 를 과발현시키거나 억제시킨 조건에서의 실험 결과를 통해서도 TM4SF5 가 c-Src 의 닫힌 구조의 비활성화 형태와의 결합을 더욱 선호한다는 것을 확인할 수 있었다. 세포막을 특별한 수용체의 도움 없이 통과할 수 있는 세포막 투과성 펩타이드의 서열 뒤에 TM4SF5 의 C-말단 서열을 접합시켜 만든 펩타이드는 TM4SF5 와 c-Src 의 SH1 도메인과의 결합을 방해함으로써 TM4SF5 에 의해 매개된 FAK/c-Src 의 활성을 억제하였다. 이는 TM4SF5 를 과발현시킨 세포와 형질감염을 통해 일시적으로 TM4SF5 를 발현시킨 세포, 내재적으로 TM4SF5 를 발현하는 세포 모두에서 serum 에 의존적으로 그 효과가 나타남을 확인함으로써 알 수 있었다. 나아가, 이러한 세포막 투과성 TM4SF5 C-말단 펩타이드는 TM4SF5 특이적으로 그것에 의해 매개된 세포의 전이와 침윤을 억제함은 물론, 누드 마우스에서 TM4SF5 에 의해 형성된 종양의 부피를 독성 없이 유의적으로 감소시켰다. 또한, 누드 마우스의 꼬리 정맥에 TM4SF5 가 과발현된 종양 세포를 주입시켜 폐로 전이시킨 후 세포막 투과성 TM4SF5 C-말단 펩타이드를 복강 투여하였을 때에도 대조군에 비해 폐에 형성된 종양의 수가 유의적으로 감소하였다. 이러한 결과를 통해 TM4SF5 가 c-Src 의 구조 상태에 따른 선호성을 가지며 c-Src의 kinase 도메인과 특이적으로 결합함을 알 수 있었다. TM4SF5 의 C-말단과 c-Src 의 SH1 도메인의 결합은 세포막을 투과할 수 있는 TM4SF5 C-말단 펩타이드를 처리함으로써 억제될 수 있으며, 이 펩타이드는 TM4SF5 특이적으로 세포 내의 FAK/c-Src 의 세포 활성을 조절하여 TM4SF5에 의해 매개된 세포의 전이와 침윤, 누드마우스에서의 종양 증식, 전이를 억제함으로써 항암제의 역할을 할 수 있을 것으로 기대된다.