사람 연골세포 기반 인공물질 미개입 티슈모듈 형성

Abstract

1. 연구목적 현재까지 골관절염 혹은 턱관절장애와 같은 만성질환의 원인 치료에 관해 적절한 방법이 없는 실정이며, 자가연골세포 및 줄기세포치료제는 병변의 근원적 회복에는 한계가 있다. 이에 대한 대안으로, 최근 줄기세포 등을 기반으로 거대 조직체를 생산하는 시도가 활발하게 이루어지고 있다. 조직체를 생산하기 위하여 지지체 등 인골물질개입을 이용한 시도가 주를 이루나, 최근 인공적 지지체 개입 없이 조직체를 형성하는 기술이 소개되고 있다. 본 연구에서는 사람 연골조직에서 분리한 연골세포를 이용하여 수십 ~ 수백 μm 크기의 마이크로블럭 (microblock, MB)인 세포 덩어리를 만들어내었고, 이를 재배열하여 지지체 미개입 3 ~ 4 mm 단위의 연골조직체인 티슈모듈 (tissue module, TM) 생산기술 개발을 연구목표로 하였다.

2. 연구방법 사람 연골초대배양세포는 유세포분석기 (Fluorescence-activated cell sorting, FACS)를 이용한 특성 분석 및 성장곡선 (growth curve)과 배가시간 (Population doubling time, PDT)을 측정하였다. 물리적 힘을 이용해 수십 ~ 수백 μm 크기의 MB를 생산하고, 이미 계산되어진 물리적 환경을 기준으로 3 ~ 4 mm 크기의 TM을 형성하였다. 이를 위해 다음과 같이 시험계를 구성하였다. : 대조군, 연골초대배양세포

group 1, 3일 MB

group 2, MB 3일 + TM 1일

group 3, MB 3일 + TM 3일

group 4, MB 7일 + TM 3일

group 5, MB 14일 + TM 3일 생산된 TM은 연골로의 분화를 위해 TGF-β3를 처리하였다. 연골분화능을 증명하기 위해 glycosaminoglycan (GAG) 분석, hematoxylin-eosin (H&E) staining, massons trichrome (MT) staining 및 면역화학염색 (콜라겐Ⅰ, 콜라겐Ⅱ)을 실시하였다. SPSS Statistics 23.0 software를 이용하여 통계 분석하였다.

3. 연구결과 본 연구에서는 6계대 연골세포를 연구에 사용하였으며, 이들은 2계대 연골세포들과 유사한 형태를 유지하였고, 증식능도 유사하게 유지되었다. 연골세포의 FACS 결과 줄기세포 표면항원의 발현이 CD73을 제외하고는 95% 이상 높은 결과치를 얻었으며, hematopoietic cell marker에 대해서는 거의 발현되지 않았다. TM의 형태분석을 위한 shape factor 측정 결과, circularity 및 roundness 값의 변화가 group 3보다 group 4에서 더 낮게 측정되었다. 연골 분화 지표인 GAG 절대 함량은 MB 배양 기간이 길어짐에 따라 줄어드는 경향성을 보여 MB배양을 14일간 했던 group 5에서 가장 값이 낮고, 전체 그룹의 GAG 정량값은 연골세포와 유사한 수치를 나타내었다. H&E staining, MT staining 결과, 다량의 세포 외 기질이 관찰되었으며, 콜라겐Ⅱ는 전체 그룹에서 유사하게 유지되는 것을 확인하였다.

4. 결 론 본 연구는 연골초대배양세포로부터 3-4 mm 크기의 TM 생산기술을 확보하여, 향후 턱관절장애나 골관절염의 기존 치료법의 한계를 극복할 수 있는 플랫폼을 제시한다.

1. Objectives There are limitation of therapies for osteoarthritis and temporomandibular disorder. Recently, autologous chondrocyte implantation and stem cell therapy are used for patients, but the effect is limited. To overcome this problem, many researchers are trying to develop three-dimentional cartilage-mimic structures. In this study, we developed millimeter-scale cartilage-mimic tissue module, artificial material-free based on primary chondrocyte.

2. Methods Firstly, micrometers scaled microblock was produced using chondrocytes. Secondly, tissue module was generated using microblocks. Human primary chondrocytes were characterized by FACS and growth curve, population doubling time. I designed the experimental groups to optimize the best conditions for TM culture as following (Control group, human primary chondrocytes

group1, 3 days MB

group2, MB 3 days TM 1 day

group3, MB 3 days TM 3 days

group4, MB 7 days TM 3 days

group5, MB 14 days TM 3 days).

3. Results Human primary chondrocytes at passage 6 were used for this study and significant differences were not represented between passage 2 and 6 in population doubling time and growth curve. Circularity and roundness were measured to analyze shape properties of TM. The variation of circularity and roundness was lower in group 4 than group 3. In GAG analysis, 3 days MB culture group represents higher GAG contents than control group.

4. Conclusion I demonstrated that MB and TM have chondrogenic characteristic as much as human primary chondrocytes. Additionally I provide the platform for 3D scaffold-free culture system that can apply to the limitation of conventional TMD or OA therapy.