Novel functions of Rad52 in chromosome bi-orientation during mitosis

Abstract

염색체 bi-orientation은 세포분열과정에서 복제된 한쌍의 염색체가 두 개의 딸세포로 나누어질 때 염색체의 수를 정확하게 유지하고 세포가 지속적으로 생존할 수 있도록 하는데 필수적인 과정이다. 진핵세포는 세포분열과정에서 염색체 bi-orientation을 정확하게 조절하기 위한 기작들을 진화적으로 발전시켜 왔고, 특히 Aurora B 인산화 단백질은 spindle과 kinetochore의 연결 상태를 점검하고 spindle assembly checkpoint (SAC)을 활성화시키는데 핵심적인 역할을 한다고 연구되었다. 본 연구에서 사용된 Saccharomyces cerevisiae에서는 Aurora B 인산화 단백질의 출아효모 상응 단백질인 Ipl1이 인산화 과정을 통해 SAC을 조절한다고 알려져 있다. 세포분열 중에 spindle과 kinetochore가 제대로 연결되지 않으면, Ipl1은 이러한 비정상적인 연결을 감지하고 SAC을 활성화시키는 인산화 단백질인 Mps1을 spindle과의 연결이 손상된 kinetochore 쪽으로 위치하도록 조절한다. Kinetochore에 위치한 Mps1은 Mad1과 Mad2 등의 SAC 단백질을 kinetochore로 불러들이고, Knl1과 Bub1을 인산화시켜 SAC pathway 를 활성화시킨다. 이렇게 활성화된 SAC은 metaphase에서 anaphase로의 전환을 억제하고 비정상적인 spindle과 kinetochore의 연결을 수정한다. 최근의 연구에 따르면 여러종류의 암세포에서 SAC이 제대로 작동하지 못하도록 하는 돌연변이들이 발견되고 있기 때문에, SAC의 자세한 조절기작을 연구하는 것은 암세포 형성과정에 대한 이해를 넓혀줄 것으로 기대된다. Rad52는 세포 내에서 일어나는 상동재조합 과정에서 핵심적인 역할을 수행하는 것으로 알려진 단백질이다. S phase에서 일어나는 DNA 복제과정 중에는 내외부적인 다양한 원인으로 DNA double strand break (DSB)가 발생한다. 이러한 DSB는 세포가 유전정보를 유지하고 생존하는데 치명적인 문제점으로 작용하기 때문에 대부분 Rad52를 통한 수리기작으로 복원된다. 이렇게 DSB의 수리를 위한 Rad52의 기능들은 이미 오랫동안 연구되어 왔지만, Rad52가 추가적으로 가지고 있을 새로운 기능들에 대한 연구는 미흡한 것이 사실이다. 본연구는 Rad52가 SAC과 Ipl1 complex를 구성하는 유전자들과 유전적 연관성을 가지고 있음을 발견함으로써 Rad52의 새로운 기능이 mitosis과 관련이 있을 가능성을 확인하였고, RAD52 유전자가 제거된 균주를 이용하여 Rad52 단백질이 spindle이 손상된 환경에서는 SAC을 활성화하고, 일반적인 세포분열과정에서는 염색체 bi-orientation을 조절하는 핵심적인 역할을 수행함을 확인하였다. 또한 본 연구에서 밝힌 기능들은 진핵 세포에서 잘 알려진 상동염색체 재조합 기능이나 Candida albicans에서 알려진 kinetochore 구조를 유지하는 기능과는 무관한 추가적인 것임을 확인하였다. 이와 함께, Rad52가 핵심적인 mitosis조절 인산화 단백질인 Ipl1과 SAC을 활성화시키는 인산화 단백질인 Mps1에 의해서 인산화가 이루어지는 새로운 기질 단백질임을을 in vitro kinase assay를 통해 확인하였다. Rad52가 mitosis를 조절하는 정확한 기작을 알기 위해서, Ipl1 또는 Mps1에 의해서 인산화가 되지 않는 돌연변이 단백질들과 지속적으로 인산화가 되어 있는 효과를 나타내는 돌연변이 단백질들을 세포 내에서 발현시켜 생리적인 효과를 관찰하였다. 그 결과, Ipl1은 Rad52를 인산화시킴으로써 Mps1을 kinetochore쪽으로 위치하도록 조절하고, Mps1은 Rad52를 인산화시킴으로써 spindle이 손상된 상황에서 SAC이 활성화되도록 조절한다는 것을 밝혀 내었다. 이러한 연구 결과를 통하여, 본 연구는 Rad52가 염색체 분열이 정확하게 일어날 수 있도록 조절하는 중요한 역할을 수행하고 있음을 확인하고, mitosis 조절 기작의 세부적인 이해를 제공하였다.

Chromosome bi-orientation is essential to maintain chromosome number and cell viability. For accurate chromosome segregation, eukaryotic cell monitors the state of spindle-kinetochore attachment by Aurora B kinase, which is a crucial factor of the spindle assembly checkpoint (SAC). In Saccharomyces cerevisiae, SAC is regulated by the phosphorylation signal generated by budding yeast Aurora B kinase, Ipl1. When spindle-kinetochore attachment is damaged, Ipl1 recognizes aberrant spindle-kinetochore attachment and recruits SAC activator kinase Mps1 to unattached kinetochore. Kinetochore-accumulated Mps1 recruits SAC proteins such as Mad1, Mad2, and Bub1 to kinetochore and phosphorylates substrates in SAC pathway such as Knl1 and Bub1. Subsequently, activated SAC inhibits the anaphase progression to correct mis-linked spindle-kinetochore connections. Recent studies reported that various kinds of tumor in vertebrate have problem in SAC. Thus defining the details of SAC is helpful to understand mechanism of tumor generation. Rad52 is key subunit in homologous recombination machinery. During DNA replication in S phase, DNA double strand breakage caused by internal or external reasons is recovered by Rad52-dependent repair pathway. Although the function of Rad52 in DNA damage repair pathway is well studied, other functions are not uncovered yet. Present study found evidences that Rad52 has genetic relationship with subunits of SAC and Ipl1 complex. By using RAD52 deletion strain, it was clearly confirmed that Rad52 is crucial factor for SAC activation under spindle damage condition and chromosome bi-orientation under normal mitosis. Mitotic functions of Rad52 are not related to previously reported functions of Rad52, which are homologous recombination activity in eukaryotic cells and kinetochore structure maintenance in Candida albicans. It was also verified that Rad52 is novel substrate of major mitotic kinase Ipl1 and SAC activator kinase Mps1 by in vitro kinase assay. To find regulatory mechanism of Rad52 functions in mitosis, physiological functions of Rad52 phosphorylation were examined. By using non-phosphorylable mutants and phospho-mimicking mutants, it was confirmed that Ipl1 phosphorylates Rad52 to recruit Mps1 to the kinetochore and Mps1 phosphorylates Rad52 to activate SAC under spindle damage condition. Based on the obtained results, present study suggests novel functions of Rad52 in accurate chromosome segregation.