Development of a cell-laden thermosensitive chitosan bioink for 3D bioprinting

Abstract

3D 바이오 프린팅은 세포가 함유된 하이드로겔을 적층방식으로 가공하여 복합 조직을 만드는 기술이다. 그러나 대부분의 하이드로겔은 가교제를 사용하여 화학적으로 결합하기 때문에 독성을 유발할 위험성이 있다. 반면에 열감응성 하이드로겔은 가교제가 필요 없기 때문에 더 생체친화적이라고 할 수 있다. 키토산은 열감응성 하이드로겔로써 응용이 가능할 뿐 아니라 생체적합성과 골분화능력이 뛰어난 것으로 알려져 있다. 키토산을 열감응성 하이드로겔로 만들 때에는 용매와 겔화제가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그러나 아직까지 키토산을 바이오잉크로써 이용하기 위해여 용매와 겔화제의 영향을 연구한 결과는 거의 없는 실정이다. 따라서 본 연구에서는 키토산을 이용하여 용매와 겔화제에 따라 여러 바이오잉크를 개발하고 그 바이오잉크의 잠재적 효능을 알아보고자 한다. 용매에 따른 영향을 알아보는 실험에서는 겔의 모양의 양상과 겔이 되는 시간에는 큰 영향을 주지 않는 것으로 나타났으며 세포독성 실험 결과 아세트산이 가장 적합한 것으로 나타났다. 두번째로, 겔화제에 따른 영향에서는 β-GP와K2HPO4에 비해서 NaHCO3가 좀 더 적합한 것으로 나타났다. 먼저 겔화 되는 시간을 측정한 결과, 모든 그룹에서 온도가 높아짐에 따라 급격하게 시간이 줄어드는 것으로 나타났으나 K2HPO4가 가장 빠르고 NaHCO3가 가장 느리게 겔이 되는 것을 알 수 있었다. 상대적으로 겔화되는데 걸리는 시간이 오래 걸리는 NaHCO3가 프린팅할 때 노즐이 막히는 문제에 자유로울 수 있을 것으로 보였다. 점탄성측정 결과를 살펴보면, NaHCO3가 가장 높은 저장탄성률을 보였으며 이러한 특성은 겔이 되어서도 높은 것으로 나타났다. 전자현미경 사진을 통해서 표면을 관찰한 결과, 불규칙한 여러 구멍으로 구성되어 있는 것으로 나타났으며 NaHCO3와 β-혜가 상대적으로 다양한 크기의 구멍으로 하이드로겔을 구성하고 있는 것으로 나타났다. Water soluble tetrazolium salt와 live and dead 실험 결과, 유의적인 세포독성은 나타나지 않았지만 NaHCO3가 세포부착능력이 가장 뛰어난 것으로 나타났다. 키토산 바이오잉크와 PCL을 같이 프린팅하여 live and dead cell assay를 실시한 결과 특이적인 세포 독성은 나타나지 않았다. 결론적으로 키토산 바이오잉크는 아세트산을 이용하여 NaHCO3를 겔화제로 사용하는 것이 가장 적합한 것으로 나타났다.

3D bioprinting is a technology used to deposit cell-laden biomaterials for the construction of complex tissue. For 3D bioprinting of cell-laden construct, many materials have been developed such as alginate, fibrin and gelatin. However, most of these hydrogels are chemically bound using crosslinkers which can cause some problems in cytotoxicity and cell viability. On the other hand, thermosensitive hydrogels are physically cross-linked by non-covalent interaction without crosslinker, facilitating stable cytotoxicity and cell viability. The typical examples of thermosensitive hydrogels are methyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, N-isopropylacrylamide(NiPAAM), poly(ethylene glycol)/poly(propylene glycol)/poly(ethylene glycol) (PEG-PPG-PEG) and poly(ethylene glycol)/poly(lactic acid-co-glycolic acid) (PEG/PLGA). Chitosan, which has non-toxic, biocompatible and biodegradable polysaccharide composed of glucosamine and derived by deacetylation of chitin, can be used as thermosensitive hydrogels. In chitosan thermosensitive hydrogels, gelling agent and solvent are the key factors for sol-gel transition. Yet, there is no study to investigate the comparison among these gelling agents or solvent for bioink. Therefore, the purpose of this study was to develop and compare bioinks by chitosan hydrogels for 3D bioprinting. Solvent did not affect the gel shape and gelation time. However, acetic acid had good biocompatibility compared with lactic acid and hydrochloric acid. Gelling agent was more important factor than solvent. Gel shape and gelation time were different among gelling agent. NaHCO3 had greater growth rate of the storage modulus (G′) and more irregular porous structure than β-GP and K2HPO4. From the water soluble tetrazolium salt (WST) and live and dead assay data, it was proven NaHCO3 had good effect for cell adhesion. In cell-laden construct, there was no big difference among gelling agent. However, NaHCO3 had good printability compared with β-GP and K2HPO4.