Isolation and Characterization of EPN-Degrading Bacteria from Agricultural Soils

Abstract

살충제 EPN은 유기인계 농약으로 과수 및 농업 해충에 대한 살충효과가 뛰어나지만 인간 및 생태계 내 비표적 생물과 토양미생물군집에 영향을 주어 생태계의 구성 및 기능에 부정적인 영향을 미친다. 포유동물이 EPN에 노출될 경우 EPN이 신경계에 침투하여 acetylcholinesterase를 저해하여 독성을 나타낸다. 인체에 대한 고독성으로 농촌진흥청은 2011년 EPN의 농약 등록을 취소하였다. 그러나 저렴한 가격, 광범위한 활용 이라는 장점으로 여전히 아시아에서 살충제로 사용되고 있다. 포유동물뿐만 아니라 수생 생물 및 조류에게도 유독한 EPN 잔여물을 환경에서 제거하는 것은 매우 중요하다. 이러한 EPN의 영향을 줄이는 방법 중 하나는 미생물을 이용한 잔여 물질의 생분해이다. EPN의 생분해에 대한 이전 연구에서는 쥐의 체내에서 일어나는 대사과정에 관한 연구 결과만 보고되었을 뿐, 미생물에 의한 EPN의 분해는 보고되지 않았다. 본 연구에서는 EPN을 완전히 분해할 수 있는 14 종의 세균을 농업토양에서 분리하였다. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 및 REP-PCR을 통해 이들 세균이 Burkholderia, Cabelleronia, Paraburkholderia, Pseudomonas, Pseudoxanthomonas에 속하는 균으로 동정 되었고, 이들 균주는 EPN을 유일 탄소원으로 사용하여 완전히 분해할 수 있는 것으로 관찰되었다. GC-MS 방법에 의해 분해 중간 산물을 분석한 결과, EPN은 중간물질 4-nitrophenol로 변형되고 그 후 계속적인 대사를 통해 이 물질이 완전히 분해되는 것으로 관찰되었다. 기존 보고된 유기인계 분해 유전자의 primer를 이용해 PCR증폭을 한 결과 EPN의 가수분해가 일부 균주가 가지는 organophosphate degradation 유전자인 opdA에 의한 것임을 확인하였다. 이 연구는 EPN이 미생물에 의해 완전히 분해될 수 있다는 것을 확인한 첫 연구이며 이 연구에서 분리된 균주는 EPN뿐만 아니라 유기인계 살충체에 오염된 토양의 정화를 위한 미생물 자원으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

The phosphonothioate insecticide EPN, O-Ethyl O-(4-nitrophenyl) phenylphosphonothioate, has been used against orchard pests. It is also good to use against European corn borer, rice stem borer, tobacco budworm, and boll weevil. EPN, however, is highly toxic to mammals. EPN easily penetrates the nervous system and inhibits acetylcholinesterase (AChE). EPN is classified as a toxic pesticide to the human body and the registration of pesticide was canceled in 2011. But EPN has been widely used for agricultural purpose in Asia including Japan because of its low cost and broad spectrum activity. In addition to its adverse effects on mammals including humans, EPN is also highly toxic to aquatic organisms and birds. Therefore, cleanup of EPN residues from the environment is important. Objective of this study is to isolate and characterize EPN-degrading bacteria from diverse agricultural soils. In this study, fourteen EPN-degrading bacteria were isolated from agricultural soils. Based on 16S rRNA gene sequence analysis and repetitive extragenic palindromic PCR (REP-PCR), the isolates were related to members of the genera Burkholderia, Cabelleronia, Paraburkhoeria, Pseudoxanthomonas and Pseudomonas. All isolates were able to degrade and utilize EPN as a sole source of carbon and energy. Among these isolates, the isolate SH2-4 degraded EPN most rapidly. The isolate SH 2-4 was also able to degrade various organophosphorus compound such as malathion, fenthion, fenitrothion, and diazinon. The isolate SH 2-4 appeared to transform EPN to p-nitrophenol (4-nitrophenol) and further mineralize the intermediate when analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). When analyzed with PCR amplification using previously-reported organophosphorus degradation gene, some isolates showed homology with opdA gene. This is the first time that bacteria involved in EPN mineralization have been isolated. Considering the complete degradation capability of these strains, they might be useful for bioremediation purposes in fields contaminated with EPN.