Production of meso-2,3-butanediol in engineered Saccharomyces cerevisiae

Abstract

지구 온도가 상승하는 지구온난화는 전 지구적 차원의 환경문제이다. 하지만, 화석연료의 사용으로 인한 이산화탄소 배출량은 점점 증가하고 있다. 이에따라, 화학연료 기반의 시스템을 대체할 바이오매스 기반의 시스템이 주목받고 있다. 바이오 매스는 전처리를 통하여 단당류로 전환되고 이것을 미생물이 사용함으로써 유용한 바이오 연료 및 화학물질을 생산할 수 있다. 본 연구에서는 바이오매스 기반의 미생물공장화 기술을 구축하여 바이오 화학 소재를 생산하고자 하였다. 2,3-Butanediol (2,3-BD)는 식품 첨가제와 플라스틱 물질의 전구체로서 다양한 적용범위를 가지는 범용성 물질이다. 그 중 meso-2,3-BD는 항균성이 높고 보존력이 있어 화장품 첨가제나 작물 보호제로서 이용가치가 있다. 현재까지 미생물을 기반의 meso-2,3-BD를 생산은 주로 박테리아 기반의 생산에 관한 연구이다. 이것은 고수율로 2,3-BD를 생산할 수 있지만 이들 대부분이 병원성 균으로 분류되기 때문에 안전성의 문제가 제기 되며, 박테리오파지 등의 잡균에 감염이 쉬워 산업적인 공정을 구축하는데 어려움이 따른다. 그 대안으로 Saccharomyces cerevisiae는 GRAS (Generally Recognized As Safety) 미생물로서 안전하다고 알려져 있고, 상업적인 에탄올 생산에 이용되어 산업적 이용 가능성이 입증되었다. 하지만 야생형의 S. cerevisiae는 소량의 R,R-2,3-BD를 한다. 선행연구자에 의해 pyruvate decarboxylase 활성이 완전히 저해된 효모 (SOS5)에서 R,R-2,3-BD의 생산성을 높인 연구가 진행된 바 있다. 본 연구에서는 선행연구를 기반으로 하여, 에탄올 생합성 경로가 제거된 효모에서 meso-2,3-BD를 생산하는 연구를 수행하였다. 이를 위하여 효모에 meso-2,3-BD의 생산경로를 도입하고, meso-2,3-BD의 생산에 있어 높은 수율과 생산성을 얻는 것이 최종 목표이다. 구체적으로는 선행연구자에 의해 구축된 pyruvate decarboxylase 활성이 저해된 효모(SOS5)에 2,3-BD 생합성 경로를 도입한 균주 (SOS5 dG SDN)를 모 균주로 선택하였다. 이 균주는 도입된 alsS와 alsD 유전자에 의해 생성된 acetoin을 효모가 자체적으로 가지고 있는 BDH1 유전자를 이용하여 R,R-2,3-BD로 전환하는데, 이 유전자를 CRISPR Cas9 방법으로 파쇄 함으로써 R,R-2,3-BD가 생성되는 것을 방지하였다. 이후, acetoin을 meso-2,3-BD로 전환하는 유전자를 박테리아로부터 도입하였다. meso-2,3-BD를 생성한다고 알려져 있는 여러 박테리아 중 Risk group 1으로 알려진 Klebsiella oxytoca을 선택하였고, 이것의 budC 유전자를 플라스미드로 과발현하였다. 이렇게 구축된 균주를 플라스크에서 발효하여 그 효과를 확인하였다. 분리되지 않는 2,3-BD의 이성질체를 가스크로마토그래피 (GC)으로 정성 분석하여 R,R-2,3-BD는 생성하지 않으면서 meso-2,3-BD만 생성하는 것을 확인하였다. 다음으로, meso-2,3-BD의 합성의 수율과 생산성을 높이기 위한 연구를 진행하였다. 첫째로, 에탄올 생합성 대사과정이 모두 제거된 효모는 acetyl CoA, 아미노산 등 생장에 필수적인 물질을 합성하지 못한다. 이를 위해 발효 중 C2 compound로써 에탄올 공급이 필요하다. 따라서, 에탄올이 없는 배지에서도 잘 자랄 수 있도록 C2 compound에 비 의존적인 균주를 제작할 필요가 있다. 이를 위해 낮은 PDC 활성도를 가지는 Candida tropicalis 유래의 PDC1을 CRISPR Cas9 방법으로 BDH1 자리에 삽입하였다. 그 결과 회분식 발효에서 에탄올 공급 없이, 112 시간에 24.0 g/L의 meso-2,3-BD를 생산하였으며 대조군 대비 생산성이 2.3 배 향상되었다. PDC activity assay를 통해 CtPDC1 도입 전에 비해 PDC의 활성도가 증가한 것을 확인하였다. 이 후 대량생산을 위하여 발효조에서 유가식 발효를 진행 하였다. 그 결과 77시간에 131 g/L의 meso-2,3-BD를 생산하였고, 0.46 g/g의 수율과 1.71 g/L·h의 생산성을 나타내었다. 두번째로, 이전 발효 양상을 보면 발효 후반부로 갈수록 부산물로 acetoin이 축적되는 문제가 있어 이를 개선하는 연구를 하였다. 이러한 한계를 극복하기 위하여 acetoin을 meso-2,3-BD를 전환하는 budC를 추가로 발현하였다. 이를 위해, 강한 프로모터를 사용하였으며 CRISPR Cas9 system으로 염색체에 삽입 하였다. 플라스크 수준으로 회분식 배양을 진행한 결과 대조군은 93시간에 20.0 g/L를 생산한 것에 비해 실험군은 31.5 g/L의 meso-2,3-BD를 생산하였고, 생산성이 1.6 배 증가한 결과를 얻었다. 이 후 대량생산을 위해 발효조에서 유가식 배양을 진행하였다. 그 결과, 95시간에 171 g/L의 meso-2,3-BD를 생산하였다. 또한, 이론 수율의 98%에 해당하는 .49 g/g의 수율과 1.80 g/L/g의 생산성을 얻었다. 이를 통하여 재조합 S. cerevisiae인 S5 dG::T3bC dB::G2Ct SDNC 균주는 meso-2,3-BD를 고 순도로 생산할 수 있는 균주임을 증명하였다. 본 연구를 통하여, 박테리아만 생산가능 했던 meso-2,3-BD를 효모에서 생산하였으며, 에탄올 생합성 경로가 삭제된 효모의 한계를 극복하고 부산물을 최소화함으로써 산업적인 이용가치를 향상시켰다.

Global warming is an environmental issue at a national level. However, carbon dioxide emissions are still increasing with the use of fossil fuels. Therefore, the biomass-based systems have been attracting attention to replace the petroleum-based systems. This has an advantage of being carbon neutral because the carbon dioxide generated is absorbed again by biomass. In this study, the biomass-based microbial factory technology was constructed to produce bio-chemicals. Among various candidates for meso-2,3-butanediol (meso-2,3-BD) has valuable properties as a cosmetic additive and crop protectant. Most microbial fermentations for meso-2,3-BD production have been focused on bacterial based process, however, most of them are pathogenic and they are liable to be contaminated with other germs such as bacteriophages. This makes difficult large-scale fermentations in terms of safety and industrialization. As an alternative, Saccharomyces cerevisiae is a GRAS (Generally Regarded As Safe) microorganism and has proven its industrial value as being used for commercial ethanol fermentation. However, a wild type S. cerevisiae synthesizes a small amount of R,R-2,3-BD not meso-2,3-BD. In previous studies, pyruvate decarboxylase (Pdc)-deficient S. cerevisiae with the R,R-2,3-BD synthetic pathway was constructed (Kim et al., 2017). In this thesis, the R,R-2,3-BD biosynthetic pathway was eliminated by the CRISPR-Cas9 gene editing system and the pathway for producing meso-2,3-BD was constructed by overexpressing acetoin reductase (budC) from Klebsiella oxytoca. Finally, the engineered strain produced meso-2,3-BD without producing R,R-2,3-BD. More research efforts were made in order to improve the yield and productivity of meso-2,3-BD production. First, Pdc-deficient S. cerevisiae requires a trace amount of C2-compound such as ethanol for cell growth. The previous research found that Pdc-deficient S. cerevisiae expressing the Candida tropicalis PDC1 gene (CtPDC1) represented an improvement of the tolerance in non-ethanol supplemental medium (Kim et al., 2016). In this study, the CtPDC1 gene was integrated into the chromosome with a weak constitutive promoter, GPD2 promoter, by CRISPR-Cas9. With expression of the CtPDC1 gene, biomass yield of 2.64 g DCW/ g glucose and a 2,3-BD titer of 24.0 g/L were obtained. The productivity of meso-2,3-BD was 0.21 g/L/h which was 2.3 folds higher than that of the control (0.09 g/L/h). The S5 dG dB::G2Ct SDNC strain produced 131 g/L of meso-2,3-BD with 1.64 g/L/h of productivity and 0.47 g/g of yield in the fed-batch fermentation without ethanol supplement. Second, the budC gene were expressed additionally by using a strong constitutive promoter to further improve yield and productivity for meso-2,3-BD produce and to reduce acetoin as a by-product. The engineered strain S5 dG::T3bC dB::G2Ct SDNC resulted in an improvement of both yield and productivity. For the fed-batch fermentation with the engineered strain, 171 g/L meso-2,3-BD was produced in 93 h cultivation. The yield of meso-2,3-BD (0.49 g/g) was corresponded to 98 % of the theoretical yield. The engineered S. cerevisiae strain constructed in this study successfully produced meso-2,3-BD with high yield and productivity.