Development of a novel chimeric lysin(gCHAP-LysK) against Staphylococcus aureus

Abstract

Staphylococcus aureus는 사람, 가축 및 가금의 다양한 감염증을 초래하며 다양한 항생제 내성을 갖는 다약제 내성균의 증가로 대체 항생제 개발이 활발히 이루어지고 있다. 이들 중 박테리오파지에 의해 생성되는 리신(lysin)은 세포벽을 구성하는 두꺼운 펩티도글리칸(peptidoglycan) 층의 화학 결합을 끊어주는 효소 활성으로 세포벽을 약화시켜 살균 효능을 나타낸다. 박테리오파지 리신은 역할에 따라 효소 활성 및 세포벽 결합 도메인으로 구성되어 있으며 효소 활성 도메인은 한 개 또는 두 개 효소 기능을 갖는 경우가 대부분이다. 각각의 효소 활성 및 세포벽 결합 부분은 모듈로 존재하여 개별 분리해도 고유의 활성을 보이므로 이들을 다양하게 조합하여 활성이 높고 살균 범위도 넓은 다양한 인공 리신이 개발되고 있다. 최근 활발한 게놈 연구를 통해 S.aureus의 게놈 상에 다양한 리신 유전자뿐만 아니라 세균 분열 시 작용하는 자가 리신(autolysin) 유전자도 알려져 있어 이들의 모듈을 조합하여 새로운 인공 리신을 개발할 수 있다. 본 연구에서는 S.aureus의 강력한 용균 파지인 ϕK 리신 유전자의 cysteine, histidine-dependent amidohydrolases/peptidase (CHAP) 또는 amidase (Ami) 모듈을 모든 S.aureus의 게놈 상에 존재하는 CHAP 또는 Ami 모듈로 치환함으로써 2개의 인공 리신을 작출하였다(gCHAP-LysK 및 gAmi-LysK). 대장균 S30 추출물을 기반으로 한 시험관전사/번역 (in vitro transcription/translation, IVTC/TL)과 집락 감소 효능 시험을 이용하여 인공 리신의 소 유방염 유래 S.aureus (PMB4)의 살균 활성을 평가한 결과 gCHAP-LysK의 살균 활성을 확인하였다. 또한 인공 리신을 대장균에서 발현하고 Ni-NTA chromatography로 정제하여 PMB4에 대한 살균 효능을 집락 감소 및 탁도 감소 효능시험으로 검사한 결과 살균 효능을 재확인 하였다. 따라서, 시험관전사/번역법은 대장균 발현 과정 없이 다양한 인공 리신의 살균 효능을 시험관에서 신속하게 동정하는데 사용될 수 있으며 새로운 인공 리신인 gCHAP-LysK는 소 유방염의 주요 원인인 S.aureus에 대한 항생제 후보 물질로서 유용 할 것으로 기대된다

The increasing prevalence of antibiotic-resistant isolates of Staphylococcus aureus has led to develop alternative antibiotics to treat these drug-resistant pathogens. As alternative antibiotics the lytic enzymes (lysins) produced by bacteriophages weaken the integrity of thick peptidoglycan layer in the cell wall and induce destruction of bacterial body. The bacteriophage lysins are composed of two modular domains that are catalytic domain and cell wall binding domain. To date various chimeric lysins with potent antibacterial efficacies have been generated by shuffling bacteriophage lysin modules from different origins. In the present study, two chimeric lysins were generated by exchanging peptidase or amidase module of ϕK lysin with that of genomic autolysin gene, SsaA homologe or atl, of S. aureus (gCHAP-LysK and gAmi-LysK). The antibacterial activity of chimeric lysins was screened by using Escherichia coli S30 extract-based in vitro transcription and translation (IVTC/TL) and colony reduction test. The result show that the CFU of the codop-LysK- and gAmi-LysK-treated PMB4 did not decrease, but the CFU of gCHAP-LysK show a steep decrease after 30 or 60 min of incubation. The gCHAP-LysK, which confirmed the antibacterial activity by screening, was expressed in E. coli and purified by Ni-NTA chromatography. Purified gCHAP-LysK also reduced turbidity to colony forming units and Staphylococcus aureus (PMB4, strains from bovine mastitis). Thus, the IVTC/TL method can be used for rapid identification of antibacterial activity of candidate chimeric lysins, and the novel chimeric lysin, gCHAP-LysK may be useful as a candidate antibiotics against bovine mastitis S. aureus.