Single-molecule FRET Studies on Factor-dependent Transcription Termination

Abstract

생명체는 한정된 자원을 바탕으로 생존해야 하기 때문에, 유전자 발현 과정은 다양한 과정을 통해서 정교하게 조절이 되도록 진화되어 왔다. 전사 종결 과정 역시 그런 유전자 발현 과정 중에 한 가지이다. 전사 종결 과정은 전사 과정의 다른 과정인 개시 과정이나 신장 과정과 달리 그 동안 상대적으로 연구가 많이 진행되지 않았다. 그나마 미생물에 있어서의 전사 종결 과정은 많이 알려져 있는데, 그 과정은 크게 내재적 종결 과정(intrinsic termination)과 인자 의존적 종결 과정(factor-dependent termination)으로 나누어진다. 내재적 종결 과정은 특정 서열에서 전사 종결 과정이 일어나는 것으로, 그 작용 원리와 작동하는 서열에 대해서 잘 알려져 있다. 반면, 인자 의존적 종결 과정은 그 인자가 Rho 인자라는 것은 알려져 있지만, 제안된 작동 원리에 대해서는 다양한 논란이 존재한다. 가장 대표적인 지점은 멈춤 지점(pausing site)가 Rho 인자의 작용에 필수적이라고 알려져 있지만, 이 사실은 Rho 인자의 작동 원리를 설명하는 대표적인 원리인 어뢰 모형(torpedo model)에 전면으로 배치된다. 어뢰 모형은 Rho 인자가 RNA 중합 효소보다 빠르게 이동을 한다는 것이 핵심 전제인데, 그 전제를 받아들인다면 굳이 멈춤 지점이 필요하지 않기 때문이다. 미생물의 인자 의존적 종결 과정의 원인 인자가 특정이 된 지 40년이 넘었음에도 불구하고, 핵심 메커니즘에 대한 논란이 이어지고 있는 것은 인자가 전사 과정이 진행되는 신장 복합체(Elongation Complex)에 어떻게 작용하는지가 정확하게 규명되지 않았기 때문이다. 즉, 인자가 작용하지 않는 경우와 달리, 인자가 RNA에서 Rho가 붙는 rut 위치(rut site, Rho utilizing site)에 붙는 과정만 존재하는지, 인자가 RNA 중합 효소에 직접 붙는지에 대해서 정확하게 규명을 해야 인자 의존적 종결 과정에 대한 정확하게 이해할 수 있게 된다. 본 연구에서는 인자 의존적 전사 종결 과정과 관련된 이런 다양한 문제를 해결하기 위해서, 처음으로 단일분자 FRET 연구방법을 이용해서 전사 종결 과정을 단일분자 수준에서 실시간으로 영상화하는 슬라이드 안[in vitro] 전사 종결 방법을 고안하였다. 이 방법을 이용하면 원하는 상황에서 전사 과정을 진행해서 전사 종결 과정을 확인할 수 있다. 이 연구 방법을 이용해서 종결 효율 종결 효율(termination efficiency)이나 각종 동역학(dynamics)적 지표를 집계한 결과 다양한 새로운 사실을 알 수 있었다. 먼저, 전사 종결 과정이 일어나면 크게 두 가지 다른 양상이 나타난다는 것을 처음 발견하였으며, 이 양상은 RNA 중합 효소가 DNA에 남는 것과 연관이 있음을 확인하였다. 특히, RNA 중합 효소가 DNA에 남는 경우는 크게 Rho 인자의 농도, 전사 과정에서 자유롭게 떠다니는 Rho 인자의 유무, 마그네슘 농도 등에 영향을 받는 다는 것도 최초로 발견하였다. 한편, Rho 인자가 RNA 중합 효소에 높은 친화도를 가지면서 비교적 안정적으로 부착하며, 나아가 RNA 중합 효소에 붙은 Rho 인자가 전사 종결 과정을 일으키는 것을 발견하였다. 이 과정은 rut 위치나 멈춤 위치에 더 민감하게 영향을 받는다는 것을 본 연구에서 처음으로 확인하였다. 이러한 사실을 바탕으로 본 연구는 RNA 중합 효소와 Rho 인자 사이의 상호작용이 전사 종결 과정에 어떤 역할을 하는지에 대해서 설명하였다. 뿐만 아니라, 전사 종결 기능을 상실한 Rho 인자의 돌연변이나 형광 분자를 달아서 RNA 중합 효소에 붙을 수 없는 Rho 인자를 통해서, RNA 중합 효소에 붙지 못하더라도 전사 종결 과정이 일어나는 것을 확인하였다. 이를 바탕으로, 본 연구는 기존에 제기된 두 가지 전사 종결 경로를 확인하였고, 나아가 이들 두 전사 종결이 동시에 일어날 때 전사 종결 과정의 효율이 높아지는 시너지 효과가 나타나는 것을 통해 Rho 전사 종결 과정의 창발적 속성을 확인하였다.

Living organism has to survive under limited-resource condition with the consequent result that gene expressions in the organism have evolved to be more exquisitely controlled. Transcription termination is one of the mechanism involved in the gene expression. Compared to other part of transcription procedure, such as initiation and elongation, transcription termination is yet to be elucidated. In the case of microorganism, fortunately, many scientists have carried out studies on the mechanism of transcription termination. As a result, we have already known that there are two mechanisms in transcription termination, intrinsic termination and factor-dependent termination, by necessity of specific factor. Intrinsic termination happens in specific sequence, so we have already known how it happen and what sequences it causes. On the other hand, factor-dependent termination, there are disputes concerning suggested mechanisms, even though we identified factor Rho as the factor causing this termination. One of them is contradiction between pausing site as essential component and torpedo model. If we accept the torpedo model, we thought factor Rho translocate faster than RNA polymerase, which means pausing site is not essential. Its because of ignorance of the factors role in Elongation complex during the transcription that there is dispute over the core mechanism of the factor despite of it being almost 40 years since identifying which the factors involved in factor-dependent transcription. In other words, knowing the factor-dependent transcription requires to understand whether there is only procedure for factor Rhos binding to rut site (Rho utilizing site) in RNA or there is another procedure for factor Rhos binding to RNA polymerase. To solve the several problems of factor-dependent transcription, we designed in vitro transcription termination assay for the first time to image the transcription both temporally in real time and spatially in single molecule scale using single molecule FRET. By using this method, transcription procedure was observed in targeted situation. We investigated several new factors by analyzing the data such as termination efficiency or several dynamics using this method. Firstly, we found there are two aspects in factor-dependent transcription, and these aspects are related to the RNA polymerases remaining on DNA. Especially, whether RNA polymerase remains on DNA is effected by factor Rhos concentration, existence of freely diffusing factor Rho, and magnesium concentration for first time. Moreover, we found that factor Rho binds to RNA polymerase with high affinity, and that factor Rho bound to the RNA polymerase cause the transcription termination. This termination is more sensitive to rut site or pausing site than the termination caused by factor Rho which is not bound to RNA polymerase. Based on these facts, we explained how the interaction between RNA polymerase and factor Rho takes role in transcription termination. Finally, we observed transcription in the absence of factor Rhos binding to RNA polymerase using factor Rho mutant which lost function of termination and fluorescence dye labeled factor Rho which lost function of binding to RNA polymerase. Thus, we observed two different pathways proposed in previous studies. Furthermore, we found emergent properties of factor Rho that there is synergic effect when two different pathways of termination happen at once.