Investigation of surface charge effects on biomolecule transportin solid-state nanopores

Abstract

나노포어 센싱 기술은 생체분자가 나노포어를 통과할 때 발생하는 이온 흐름의 감소를 통해, 분자의 물리적인 크기나 전하 상태를 단분자 수준에서 분석하는 기술이다. 이러한 나노포어의 종류로는 구멍이 존재하는 구조의 단백질을 사용하는 바이올로지컬 나노포어와, 인위적으로 형성된 멤브레인에 구멍 구조를 형성하여 사용하는 솔리드 스테이트 나노포어가 있다. 바이올로지컬 나노포어는 1.4 nm 수준의 일정한 구멍 구조과 이로 인한 비교적 높은 감도를 바탕으로, 염기서열 분석 기술 분야에서 많은 주목을 받고 있다. 반면, 솔리드 스테이트 나노포어는 구멍의 크기와 구조를 조절할 수 있다는 점이나 멤브레인이 기계적 화학적으로 안정하다는 점을 바탕으로, 적용 가능한 분석물의 범위가 넓다는 장점을 보인다. 이에 다양한 종류의 생체분자들과 그 복합체들의 크기 검출을 통해 약물 스크리닝과 같은 생물학적인 의미를 가지는 응용분야에서 활용 가치가 높다. 현재 이러한 솔리드 스테이트 나노포어 기술을 발전시키기 위하여 감도 향상과 분자의 움직임 최적화 측면에서 많은 노력이 이루어지고 있다. 본 학위논문에서는 분자의 움직임 최적화를 위하여 나노포어의 표면전하 특성을 활용하고자 하였다. 표면전하 특성은 전기삼투유동이나 정전기적 간섭을 통해 분자의 움직임에 영향을 미치며, 이러한 관점에서 진행되었던 연구들을 제 2장에서 정리하였다. 또한, 표면전하를 조절하기 위하여 이 학위논문에서 활용된 접근 방식에 대하여 설명하였다.

제 3장에서는 실리콘 나이트라이드 나노포어에 레이저 빔을 조사함으로써 음전하를 유도하고, 레이저 파워의 조절에 따른 DNA의 움직임 변화를 관찰하였다. 음전하의 조절과 함께 생체분자의 통과를 고감도로 검출하기 위해서는, 보편적으로 사용되는 실리콘 기판 소자에서 보고되었된 레이저에 의한 전기적 잡음을 낮출 필요가 있었다. 이에 먼저 기존 실리콘 기판 소자와 유리 기판 소자의 잡음 특성 비교 분석을 통해, 잡음의 원인이 실리콘과 전해질의 계면에서 발생하는 수소의 환원반응임을 밝혀냈으며, 유리 기판 소자의 저잡음 특성을 발표하였다. 이후 유리기판 소자에서 레이저 파워에 따른 음전하의 증가를 이온 전류 측정을 통해 계산하였다. 증가된 음전하로 인해 DNA의 통과방향과 반대방향으로 발생하는 전기삼투유동은 DNA 포획 빈도를 감소시키는 반면, 통과 속도에는 영향을 주지 못했다. 또한, 저잡음 기판과 금속층이 결합된 멤브레인을 결합하여 플랫폼 소자를 개발하였고, 높은 신호대 잡음비로 생체분자의 전기적/광학적 동시 측정 결과를 보고하였다. 개발된 플랫폼 소자를 이용한 동시 측정은, 분자 움직임의 추가적인 확인이 가능하다는 점, 두 가지 측정 방법의 장점을 결합시킬 수 있다는 점에서 가치가 크다.

제 4장에서는 유기분자층을 층층이 기상 증착하는 분자층 증착법을 이용하여 강한 음전하를 띄는 폴리우레아 나노포어를 제작하고, DNA와 단백질의 통과 움직임을 관찰하였다. 폴리우레아 물질의 경우 기계적 안정성과 화학적 저항성을 갖추어, 전사 공정을 통하여 10 nm 이하 두께의 멤브레인 제작이 가능했고, 투과전자현미경을 이용하여 수 nm 수준에서 나노포어의 직경을 조절할 수 있었다. 폴리우레아 나노포어는 기존 실리콘 나이트라이드 나노포어와 비교하여 4배 이상의 강한 음전하 특성을 보였다. 이로 인해 발생한 강한 전기삼투유동은 음전하를 띄는 DNA의 전기영동 포획을 억제하였으며, 반대로 양전하를 띄는 MDM2 단백질의 전기영동 포획 빈도를 높였다. 제 3장에서의 DNA 측정결과와 마찬가지로, 전기삼투유동은 두 생체분자의 통과속도에는 영향을 주지 못했다. 오히려 정전기적 간섭으로 인해 폴리우레아 나노포어에서 MDM2의 통과속도가 늦춰지는 것을 확인하였다.

이 학위논문에서는 나노포어의 표면전하 특성이 생체분자의 움직임에 미치는 영향에 대해 논의하였다. 두 가지 방식의 접근을 통해 전기삼투유동이 생체분자의 나노포어 포획에 주된 구동력임을 밝혔으며, 단백질의 통과 속도를 정전기적 인력이 늦출 수 있음을 처음으로 보고하였다. 최종적으로, 분석물과 반대의 전하를 띄는 나노포어의 활용이, 첫째, 포획 빈도를 높여 분석 효율과 처리량을 증가시키고, 둘째, 통과속도를 늦추어 시간적 분해능 요구를 낮춤으로써, 검출 효율을 향상 시킬 수 있음을 제시하였다.

Nanopores have emerged as a biomolecule sensing platform for label-free detection with single molecule accuracy. Here, molecules that translocate through a nanometer-size holes in a thin membrane can be detected by measurable changes in ion current, which can be associated with the structural features of molecules, such as physical size and charge state. Traditionally, nanopore research has been divided into two areas: (1) biological nanopore using pore-forming protein, embedded in a lipid bilayer membrane, such as alpha-hemolysin and MspA, (2) solid-state nanopore employing fabrication technologies such as electron beam drilling of thin membranes or laser assisted pulling of glass capillaries. The biological nanopores are attracting much attention in the field of DNA sequencing because of their relatively high sensitivity from the fixed dimension of 1.4 nm. In contrast to biological nanopore, solid-state nanopore is better suited for wide range of analytes, for instances, dsDNA, proteins, and DNA-protein complexes, based on its advantages of mechanical and chemical durability, flexibility in the pore size. Currently, a key issue for advancing solid-state nanopore technology is a sensitivity issue and a translocation behavior issue. In this dissertation, surface charge characteristics of nanopore have been utilized to control and optimize the translocation behavior of molecule, such as, capture, transport, and clogging. The surface charge of nanopore could affect translocation behavior through electro-osmotic flow or electrostatic interaction, and the previous studies that have been conducted in this point of view are summarized in chapter 2. In addition, the strategies used in this dissertation to modify the surface charge of nanopore were discussed.

In chapter 3, surface charge induced by light illumination in silicon nitride nanopore and the influence on DNA translocation were investigated. In order to detect the DNA translocation with sufficient signal-to-noise ratio, the strong increase of ionic noise upon laser illumination in commonly used Si substrate based nanopore had to be solved. At first, we analyzed the noise characteristics of Si substrate and glass substrate based nanopore, and suggested that the origin of noise is photo-reduction of hydrogen at the Si/electrolyte interfaces. The increase of negative surface charge as a function of laser power in the glass substrate based nanopore was calculated from ion current. The electro-osmotic flow, which is generated in the direction opposite to the direction of DNA translocation, reduced the capture frequency, but had no influence on the translocation speed. In addition, we proposed a platform device using a low-noise glass substrate and metal-integrated membrane, and demonstrated the synchronized optical and electronic detection of fluorescence labelled DNA with high signal-to-noise ratio. Our low noise nanopore platform is of great value in combine the advantages of both detection methods and in further confirming the molecule translocation.

In chapter 4, polyurea nanopore was fabricated by using molecular layer deposition, and the translocation behavior of DNA and protein was investigated. The polyurea membrane was chosen due to its high mechanical stability and chemical resistance, which is responsible for reducing the pore volume of several-nanometers in all dimensions. Furthermore, the polyurea nanopore exhibited a high negative surface charge density more than four times that of the conventional silicon nitride nanopore. A highly developed electro-osmotic flow in polyurea nanopore resulted in the inhibition of electrophoretic capture of negatively charged DNA, and the increase of electrophoretic capture of positively charged MDM2 protein. The translocation speed of biomolecules was not affected by electro-osmotic flow, but rather the enhanced electrostatic interaction slows down the MDM2.

In this dissertation, we discuss the surface charge effect on biomolecule transport in nanopore. We have shown that the electro-osmotic flow is the major driving force for capture of biomolecules, and the influence of electrostatic interaction on protein translocation for the first time. We have suggested that the use of nanopore, which exhibit opposite charge to that of the analyte, could improve the detection efficiency in the following aspects: 1) by increasing the capture frequency, the analysis efficiency and throughput are enhanced, 2) by slowing down the translocation speed, the required temporal resolution is lowered.