Defining of plastid-mitochondrial genome flux and establishment of plant barcoding technology

Abstract

부정 원재료 혼입(Economically motivated adulteration, EMA)는 약용식물 산업에 있어서 큰 비중을 차지하는 문제로, 연간 100억에서 150억불의 비용이 이를 해결하기 위해 소비되고 있다. 약용식물 산업의 지속적이고 안정적인 성장을 위해서는 올바른 판별법에 기초한 신뢰할 수 있는 원재료가 공급되는 것이 중요하며, DNA 바코딩은 이를 위한 효과적인 해결책으로 각광받고 있다. 그러나 대부분의 약용 식물들은 순화나 육종을 거치지 않고 야생에서 채집되어 유통되거나 재배되고 있어 넓은 범위의 생물 다양성을 그대로 가지고 있는 경우가 많다. 또한 미토콘드리아, 엽록체에서 일어나는 양친 유전이나, 핵 게놈을 포함한 이들 세 유전체 간의 수평 유전체 교환 (Horizontal genome transfer)등과 같이 식물 유전체가 가지고 있는 복잡한 특성들이 미치는 영향들은 과소평가 되고 있다. 그러나 이러한 특징들을 고려하지 않고 무분별하게 DNA 바코딩을 적용할 경우 종 판별에 있어서 더 큰 혼란을 초래할 수 있으며 산업 전반을 침체시킬 수 있다. 실제로 2015년 미국에서는 DNA 바코딩 결과를 토대로 뉴욕 검찰이 주요 건강 기능성 식품 회사에 판매중지 가처분 신청을 내렸으나 곧 번복하였으며, 한국에서도 백수오를 원료로 하는 건강기능성 제품에 근연종 이엽우피소가 혼입되었다는 보도로 인하여 큰 혼란을 겪은 적이 있다.

첫 번째 장에서는 앞서 언급한 백수오와 이엽우피소의 엽록체와 미토콘드리아 비교 유전체 연구와 올바른 마커 적용에 대한 제언에 대해 다루고자 한다. 먼저 차세대 유전체 분석 기술을 이용하여 백수오와 이엽우피소의 엽록체 및 미토콘드리아 완전장을 해독하였으며 이 두 유전체를 비교한 결과 엽록체의 35%에 해당하는 서열이 미토콘드리아에서 상동성을 가지고 있는 것을 알 수 있었다. 또한 백수오와 이엽우피소의 미토콘드리아에서 발견되는 엽록체 조각(Mitochondrial Plastid DNA, MTPT)들은 두 종간에 매우 유사하였으며, 현재 엽록체 서열들과의 유사성을 토대로 이들의 삽입 시기를 추정해본 결과, MTPT 서열들이 백수오와 이엽우피소가 분화되기 이전의 공통 조상에서부터 삽입 되었으며 미토콘드리아의 매우 느린 진화 속도로 인하여 현재까지도 매우 잘 보존되어 있는 것으로 추정되었다. 또한 81개의 속씨 식물 미토콘드리아 게놈을 조사하여 MTPT가 이들간에 매우 다양하게 존재하지만 대체적으로 분류군 별로 특이적인 패턴을 보여주는 것을 알 수 있었으며, 이들이 식물 미토콘드리아 유전체의 복잡성에 기여했을 것이라 추정하였다. 또한 실제 백수오와 이엽우피소에서 개발된 마커를 토대로 MTPT와 엽록체의 PCR 기반 동시 증폭이 종 판별에 있어 역설적인 오류를 줄 수 있음을 밝혔으며, 이를 근거로 분자 마커를 이용한 종 판별을 수행할 때의 올바른 적용 원칙을 제시하고자 하였다.

두 번째 장에서는 식물에서 불특정 혼합물에서의 차세대 유전체 분석 기술 기반 메타바코딩을 위한 엽록체 유전체 마커를 개발하고자 하였다. 기존에 구축되어 있는 국제 생물 정보 데이터 베이스의 정보를 적극적으로 이용하기 위하여 현재 식물 종 판별을 위해 널리 사용되고 있는 matK와 rbcL 유전자 지역으로부터 NGS에 적합한 크기의 PCR 산물을 만들어 낼 수 있는 마커를 디자인하였다. 또한 주요 약용식물 및 마약성 식물들도 보다 효과적으로 판별할 수 있도록 두릅나무과, 미나리과, 양귀비과, 삼과를 포함한 4개 과로부터 23개의 엽록체 유전체 정보를 확보하고, 비교유전체 분석을 이들 4개과의 엽록체 서열과 완벽하게 일치하면서도 다양성을 보이는 다수의 마커를 개발하였다. 이들은 현재 NCBI에 등록되어 있는 전체 식물군을 대상으로 진행한 가상 환경에서의 중합효소연쇄반응 (in sillico PCR)에서도 쌍떡잎 식물에서 80%, 외떡잎 식물에서 70% 정도의 성공률을 보여주었으며, 실제 DNA를 이용한 PCR 실험에서도 성공적인 결과를 얻을 수 있었기 때문에 새로운 범식물마커로 이용할 수 있을 것으로 기대된다. 4개의 엽록체 기반 마커와2개의 핵 게놈 기반 마커 및 식물 혼합물 DNA를 이용한 두 번의 NGS 적용 실험에서도, 혼합물에 어떤 시료가 들어있는 지를 보여주는 정성분석은 가능한 것으로 판단되었다. 다만, 정량분석의 경우 혼합 DNA에서 각 시료별 PCR 효율이 마커마다 차이가 있어 특정 종이 우점하는 사례가 발견되었기 때문에 보다 신중하게 해석해야 하며, PCR에 의한 오류를 줄이기 위한 추가적인 방법이 더 적용될 필요성이 있을 것으로 생각된다.

DNA barcoding technology is used to classify and authenticate herbal plants and contributes to prevent economically motivated adulteration (EMA) of those products, which is vital for the stable growth of bio-industry. The herbal industry have spent 10 to 15 billion dollars per year since 2010, to manage this issue and provide the confident herbal materials. In this respect, DNA barcoding is regarded to be a promising one to discriminate target species and EMA counterfeit. However, underestimating the genomic complexity of the plant species can cause undiscovered shortcomings in DNA barcoding and molecular taxonomy. The herbal plant has a wide range of natural diversity as they have grown in wild without breeding approach. Complex nature of plant genome such as biparental inheritance or horizontal transfer of organelle genome is often ignored and underestimated. Without considering these distinct features of the plant genome, DNA barcoding can cause confusion or even disruption of entire industry like the cases happened in 2015 about the New York attorney general and GNC in the USA, and the adulteration of Cynanchum wilfordii with C. auriculatum in Korea.

In the first chapter, I assembled complete chloroplast and mitochondrial genome of two Cynanchum species. By comparative analysis, I found that 35% of the plastid genome of both species were transferred to their mitochondrial genome (mitochondrial plastid DNA, MTPT) from their common ancestor and the fragments were maintained in conserved form due to the slow mutation rate of plant mitochondrial genome. I identified diverse and lineage-specific MTPT transfer from 81 plants mitochondrial genomes and this flux contributed to the complexity of mitochondrial genome structure. Furthermore, I inspected possible DNA barcoding paradox from co-amplification of MTPT and developed recommended guidelines for regulation of economically motivated adulteration and protecting the herbal industry.

In the second chapter, I developed multiple plant barcoding primer pairs from 23 chloroplast genomes in four families including Araliaceae, Apiaceae, Papaveraceae, and Cannabaceae. The conserved regions of chloroplast genome across the family level were discovered by multiple alignments of their chloroplast genomes and the primer sequences that perfectly match to all of the 23 chloroplast genomes were picked to reduce PCR biases. From two universal barcoding region, matK and rbcL primer pairs with reduced amplicon size were also designed for further application to the NGS platform. PCR analysis was conducted to each pair from actual plant DNA and showed successful amplification results. In silico PCR experiment to registered chloroplast genomes from both of monocot and dicot plants in Genbank demonstrates the potential use of these pairs as universal plant barcoding.