Proof-of-concept studies for clinical application of next-generation sequencing in diagnosis of rare genetic diseases

Abstract

Over the past several years, next-generation sequencing (NGS) technology has begun to replace old genetic testing technologies due to its accuracy and large target range. With the help of NGS, many disease-causing or disease-associated variants of disorders suspected to be genetic have been discovered, especially in the field of rare diseases. Nonetheless, further research is still necessary to establish the most realistic and reliable diagnostic methods for various diseases so that NGS will be more feasible in clinical practice. Clinical decision making about which molecular diagnostic tests to perform is a field of active research

the studies described in this dissertation provide options for clinicians in several different clinical circumstances.

The field of noninvasive prenatal diagnosis (NIPD) of rare genetic diseases has embraced the incorporation of NGS into clinical use. Discovery of cell-free fetal DNA in maternal plasma has led to the rapid development of NIPD. In previous studies, parental haplotypes were resolved using indirect approaches, by inference from the genotype of the proband or other affected family members. In the work this dissertation details, I improved on previous algorithms in two different ways.

In the first chapter, I describe using microfluidics-based linked-read sequencing technology to directly resolve maternal haplotypes without the probands DNA in families affected with Duchenne muscular dystrophy. In the study described in the second chapter, I use traditional indirect haplotype phasing approaches but with a common platform that can perform genotype prediction, diagnosis of the proband and carrier, as well as recombination event detection simultaneously for multiple X-linked diseases, reducing the time and cost of the analysis. Both studies show that NIPD of X-linked diseases using cffDNA and NGS is an accurate and viable method that could replace invasive testing currently in clinical use.

Chapters 3 and 4 describe how I then investigated genetic testing for rare genetic diseases that are very heterogeneous, specifically early onset epilepsy (EOE) and maturity-onset diabetes of the young (MODY). For heterogeneous diseases, the ultimate goals are genome-wide testing methods such as whole-exome or whole-genome sequencing, but in clinical application, selective gene panel tests have multiple advantages over genome-wide approaches

if appropriate genes and regions are chosen, selective tests can be more efficient, more affordable, and more easily implemented in clinical practice.

One of the major difficulties in implementing NGS clinically is variant interpretation. I tried to interpret the pathogenicity of variants more accurately by combining clinical information with publicly available archives and strictly adhering to the guidelines of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology (ACMG-AMP). Using targeted gene panel sequencing followed by thorough evaluation of the putative variants, I was able to achieve diagnostic yields similar to those of the largest and most comprehensive studies of EOE and MODY. Different factors needed to be taken into account for each disease. For example, in EOE, both the phenotypic spectrum and the type of genomic variations were diverse. Copy number variations (CNVs) and mosaic variants were detected quite frequently, increasing the diagnostic rate, whereas in MODY, no CNVs or mosaic variations were detected. Hence, designing a panel that can effectively detect low-frequency variations and CNVs is critical for EOE. For MODY, selecting the relevant genes and categorizing the clinical criteria, such as family history, symptoms, age, body-mass index, MODY probability, and C-peptide levels, were important for increasing the diagnostic rate. From both studies, I determined that strictly applying the ACMG-AMP guidelines had considerable significance, resulting in more objective and reproducible interpretations of variant pathogenicity.

NGS is a versatile diagnostic tool applicable to various diseases and in different clinical settings. In this dissertation, I propose multiple alternative approaches of NGS that can be applied to diagnosis of various rare diseases. Designating the most appropriate diagnostic method according to the characteristics of the diseases and choosing the proper target candidate genes are fundamental factors for successful clinical application.

최근 차세대 시퀀싱 (next generation sequencing

NGS) 기술은 DNA상의 넓은 타깃 영역을 정확히 읽을 수 있는 장점에 힘입어 기존의 유전자 검사 기술들을 대체하기 시작했다. 특히 희귀 질환 분야에서 특정 질병의 유전적 원인으로 의심되거나 질병과 연관된 다양한 변이들이 NGS의 도움으로 밝혀졌다. 그럼에도 불구하고 임상 분야에서 NGS의 활용 가치가 더욱 높아 지려면 다양한 질병에 대하여 현실적이고 신뢰할 수 있는 진단 방법을 수립하기 위한 더 많은 연구가 필요하다. 본 연구는 임상의가 다양한 상황에서 어떠한 분자 진단 검사를 진행할지 여부를 결정하는 데 도움이 될 것이다.

희귀 유전질환의 비침습적 산전진단 (noninvasive prenatal diagnosis

NIPD) 분야는 NGS의 임상 적용이 많이 연구되는 분야이다. 특히 산모 혈장에 존재하는 무세포 태아 DNA (cell-free fetal DNA

cffDNA)에 NGS 기술을 접목하여 새로운 비침습적 산전진단 방법을 개발하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 기존 연구들에서는 환자의 유전형을 기준 삼아 간접적으로 부모의 일배 체형을 구분 (haplotyping) 하는 방법이 가장 많이 사용되어 왔다. 본 논문에서는 기존의 haplotyping 방법을 두 가지 다른 방식으로 개선했다.

첫 번째 장에서는 듀셴 근이영양증 (Duchenne muscular dystrophy)을 앓고있는 가족에서, 환자의 DNA 없이 산모 DNA 만을 가지고 모체의 일배 체형을 직접적으로 구분하기 위해 마이크로 플루이드 기반 링크드 리드 시퀀싱 (microfluidics-based linked-read sequencing) 기술을 사용했다. 두 번째 장에서는 기존의 간접적인 haplotyping 방법을 사용하면서도, 여러 X-연관질환에 대한 공통 플랫폼을 개발하여 태아 유전자형 예측, 환자 및 산모의 원인 유전자 발굴, 그리고 유전자 재조합 검출, 모두를 한꺼번에 분석함으로써 시간과 비용을 단축했다. 두 연구 모두 산모혈장의 cffDNA와 NGS를 사용하는 X-연관질환의 NIPD가 현재 임상에서 사용 중인 침습적 검사를 대체 할 수 있을 정도로 정확하고 실용적인 방법이라는 것을 보여준다.

다음으로 세 번째, 네 번째 장에서는 조기 발병 간질 (early-onset epilepsy

EOE) 및 성숙기 발병 당뇨병 (maturity-onset diabetes of the young

MODY)과 같은 매우 이질적인 (heterogeneous) 희귀 유전질환에 대한 유전자 패널 검사를 진행했다. 이질적 질병의 경우, 전장 엑솜 시퀀싱 (whole exome sequencing) 또는 전장 유전체 시퀀싱 (whole genome sequencing)과 같은 전체 유전자 검사 방식을 실행하는 것이 가장 이상적이지만, 현실적인 임상 적용의 측면에서는 선별적 유전자 패널 검사가 전체 유전자 검사 방식에 비하여 여러 가지 장점이 있다. 질병특이적으로 적합한 유전자 패널을 설계할 수 있다면 선별적 유전자 패널 검사가 임상 실무에서 쉽게 활용할 수 있는 보다 효율적이고 합리적인 수단이 될 수 있다.

한편 임상적으로 NGS를 실행하는데 있어서 가장 큰 어려움 중 하나는 각 변이에 대한 해석이다. 이에 본 논문에서는 임상 정보와 공용 데이터베이스를 결합하고 American college of medical genetics and genomics and the association for molecular pathology (ACMG-AMP)가 제공 한 지침을 엄격히 준수함으로써 변이의 병원성을 보다 정확하게 해석하려고 시도했다. 유전자 패널 시퀀싱 및 추정 변이의 철저한 평가를 통하여, 두 질환 모두에서 현재까지 가장 크고 포괄적인 연구 결과와 유사한 진단 결과를 얻을 수 있었다. 또한, 각 질병들은 특유의 고려사항들이 있었다. 예를 들어 EOE에서는 유전자의 복사 수 변화 (Copy number variations

CNVs) 및 모자이크 변이 형이 상당히 빈번하게 검출되어 진단률을 높이는 반면, MODY에서는 CNV 또는 모자이크 변이가 검출되지 않았다. 따라서 EOE에서는 모자이크 변이 및 CNV를 효과적으로 감지 할 수 있는 패널을 설계하는 것이 중요했고, MODY의 경우 관련 유전자를 선택하고 가족력, 증상, 연령, 체질량 지수 (Body-mass index), MODY probability 및 C-peptide level과 같은 임상 기준을 분류하는 것이 진단률을 높이는 중요한 요소였다. 두 연구결과에서 모두 ACMG-AMP 가이드라인을 엄격하게 적용하고 유전자 검사 전에 포괄적인 기준을 수립하는 것이, 유전자 변이 병원성에 대한 객관적이고 재현 가능한 해석을 가능하게 한다.

결론적으로 NGS는 다양한 질병과 임상 환경에 적용 할 수 있는 다목적 진단 도구이다. 본 논문에서는 다양한 희귀질환의 진단에 적용 할 수 있는 여러 NGS 접근 방식을 제안한다. 또한, 질병의 특성에 따라 가장 적절한 진단 방법을 지정하고, 적합한 표적 후보 유전자를 선택하는 것은 성공적인 임상 적용을 위한 핵심적인 요인이라 할 수 있다.