Disulfiram, a re-positioned aldehyde dehydrogenase inhibitor, enhances radiosensitivity of human glioblastoma cells in vitro

Abstract

Background and purpose: Glioblastoma, the most common brain tumor in adults, has poor prognosis. The purpose of this study was to determine the effect of disulfiram (DSF), an aldehyde dehydrogenase inhibitor, on in vitro radiosensitivity of glioblastoma cells with different methylation status of O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) promoter and the underlying mechanism of such effect.

Material and Methods: Five human glioblastoma cell lines (U138MG, T98G, U251MG, U87MG, and U373MG) and one normal human astrocyte (NHA) cell line were cultured and treated with DSF or 6MV x-rays (0, 2, 4, 6, 8 Gy). For combined treatment, cells were treated with DSF before irradiation. Cell survival was evaluated via clonogenic assays. Apoptosis, DNA damage repair, and cell cycle distribution were assayed by Western blot for cleaved caspase-3, γH2AX staining, and flow cytometry, respectively.

Results: The mean 50% inhibitory concentration of DSF was 71.85 nM for U138MG, 101.91 nM for T98G, 90.78 nM for U251MG, 117.65 nM for U87MG, 80.69 nM for U373MG, and 99.45 nM for NHA. Then, 75 nM for U138MG and 100 nM for the other cell lines were used for subsequent experiments. U138MG and T98G were confirmed with wild type unmethylated promoter (MGMT-wt) because they expressed MGMT protein in Western blot. The other glioblastoma cell lines (U251MG, U87MG, U373MG) were verified as cells with methylated MGMT promoter (MGMT-meth). DSF induced radiosensitization in most of the glioblastoma cells, especially, in the cells with radioresistance as MGMT-wt, but did not in normal NHA cell. The mean sensitizer enhancement ratio at 0.5 of surviving fractions (SER0.5) was 1.503 for U138MG, 1.104 for T98G, 1.257 for U251MG, 1.121 for U87MG, 0.945 for U373MG, and 0.998 nM for NHA. The mean SER0.2 was 1.30 for U138MG, 1.091 for T98G, 1.119 for U251MG, 1.10 for U87MG, 0.992 for U373MG, and 0.995 nM for NHA. The mean ± standard deviation of SER0.5 and SER0.2 was 1.192±0.236 and 1.121±0.114 for all cells, 1.303±0.273 and 1.196±0.134 for MGMT-wt cells, and 1.148±0.190 and 1.087±0.070 for MGMT-meth cells, respectively. But the mean differences of SER between MGMT-wt cells and MGMT-meth cells were not statistically significant. In the experiments to investigate mechanisms for radiosensitizing effect of DSF, DSF augmented or induced cleavage of caspase-3 in all cells after irradiation. DSF inhibited repair of radiation-induced DNA damage in MGMT-wt cells, but not in cells with MGMT-meth. DSF abrogated radiation-induced G2/M arrest in T98G and U251MG cells.

Conclusion: Radiosensitivity of glioblastoma cells were preferentially enhanced by pre-irradiation DSF treatment compared to normal cell, especially radioresistant cells such as MGMT-wt cells. Induction of apoptosis or inhibition of DNA damage repair may underlie DSF-induced radiosensitization. Clinical benefit of combining DSF with radiotherapy should be investigated in the future.

배경 및 목적: 교모세포종은 성인에서 가장 호발하는 뇌종양으로 매우 나쁜 예후를 가진다. 본 연구의 목적은 교모세포종 세포에서 O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) 촉진자의 메틸화 상태에 따라 알데히드탈수소효소억제제인 디설피람이 방사선민감도에 미치는 영향을 알아보고 이와 연관된 기전을 알아보는 것이다

방법: 5종의 교모세포종 세포주(U138MG, T98G, U251MG, U87MG, and U373MG)와 1종의 정상 별아교세포 세포주 (NHA)를 배양하여 디설피람 또는 6MV X-선 (0, 2, 4, 6, 8 Gy)으로 처리하였다. 병용효과를 보기 위하여 방사선조사 전에 디설피람을 처리하였다. 세포집락형성을 기준으로 세포생존율을 구하였다. cleaved caspase-3 단백질 발현을 Western blot 을 시행하여 세포고사를 측정하였고, γH2AX 염색으로 DNA 손상 회복을 측정하였으며, 유세포분석법으로 세포주기를 측정하였다.

결과: 디설피람의 평균 50% inhibitory concentration (IC50) 값은 U138MG에서 71.85 nM, T98G에서 101.91 nM, U251MG에서 90.78 nM, U87MG에서 117.65 nM, U373MG에서 80.69 nM, NHA에서 99.45 nM 이었다. 이 결과를 바탕으로 추후의 실험에서 U138MG는 75 nM, 다른 세포주들은 100nM 의 디설피람 농도를 사용하였다. Western blot 결과 U138MG와 T98G가 MGMT 단백질을 발현하여 이 두 세포주가 MGMT 촉진자가 메틸화 되어있지 않은 wild type (MGMT-wt) 세포주임을 확인하였다. 나머지 세포주들(U251MG, U87MG,U373MG)은 MGMT 촉진자가 메틸화 되어있는 (MGMT-meth) 세포임이 확인되었다. 디설피람이 대부분의 교모세포종 세포주에서 방사선민감도를 증강시켰고 특히, MGMT 촉진자가 메틸화 되어있지 않은 MGMT-wt의 방사선저항성을 가진 세포주들에서 증강효과가 크게 나타났다. 반면, 정상 별아교세포 세포주에서는 증강효과가 나타나지 않았다. 생존분율 0.5 에서의 평균 sensitizer enhancement radio (SER0.5)는 U138MG에서 1.503, T98G에서 1.104, U251MG에서 1.257, U87MG에서 1.121, U373MG에서 0.945, NHA 에서 0.998 이었다. 생존분율 0.2 에서의 평균 sensitizer enhancement radio (SER0.2)는 U138MG에서 1.30, T98G에서 1.091, U251MG에서 1.119, U87MG에서 1.10, U373MG에서 0.992, NHA 에서 0.995 였다. 모든 세포주에서 SER0.5 의 평균 ± 표준편차는 1.192±0.236, SER0.2 의 평균 ± 표준편차는 1.121±0.114 였으며, MGMT-wt 세포들에서는 SER0.5 1.303±0.273, SER0.2 1.196±0.134 였고, MGMT-meth 세포들에서는 SER0.5 1.148±0.190, SER0.2 1.087±0.070 이었다. MGMT-wt 과 MGMT-meth 사이의 SER 값의 평균 차이는 통계적으로 유의하지 않았다. 방사선감수성 증강 효과에 대한 기전연구에서 디설피람은 5종의 교모세포종 세포주에서 모두 방사선조사 후의 cleaved caspase-3 단백질 발현을 증강시키거나 유도하였다. 디설피람은 MGMT-wt 세포들에서 방사선조사로 유도된 DNA 손상 회복을 억제하였으나 MGMT 촉진자가 메틸화 되어있는 (MGMT-meth) 세포들에서는 억제하지 못하였다. 디설피람은 T98G 와 U251MG 세포에서 방사선조사로 유도된 G2/M 정지기 세포 분율을 감소 시켰다.

결론: 교모세포종 세포의 방사선민감도는 디설피람을 방사선조사 전에 처리하였을 때 정상 세포와 비교하여 선별적으로 증강되며, 특히, MGMT-wt 세포들과 같은 방사선저항성을 가진 세포들에서 증강되는 경향이 있었다. 세포자멸사의 유도 증가 또는 DNA 손상 회복 억제가 디설피람으로 유도되는 방사선민감도의 내재된 기전으로 판단된다. 이러한 결과로 디설피람과 방사선치료의 병용에 대한 임상적인 이득은 향후 추가적으로 연구 되어야 한다.