Studies on the mechanism of regulated intramembrane proteolysis of Prss14 and its role in cancer metastasis

Abstract

Prss14 (Protease serine 14) is a type II transmembrane serine protease widely expressed in epithelial tissues. It has been reported that Prss14 is overexpressed in many cancers and plays critical roles in cancer initiation, progression, and metastasis. Prss14 undergoes ectodomain shedding in response to various stimulus including serum, TGF-β, and PMA. The fate of the membrane anchored N-terminal fragment (NTF) resulted from ectodomain shedding remains unknown. Here I show that the membrane-bound remnant, is subjected to regulated intramembrane proteolysis (RIP) and translocates to the nucleus. After PMA-induced ectodomain shedding of Prss14 mediated by tumor necrosis factor- converting enzyme (TACE), the signal peptide peptidase-like 2b (SPPL2b) cleaves the N-terminal fragment. The generated soluble Prss14 intracellular domain (PICD) is liberated from the membrane and move to the nucleus, where it regulates transcription. Strategic RNA-seq analyses revealed the PICD target genes including transcription factors, cytokines, migration and invasion-associated genes, and ubiquitin proteasome pathway-associated genes. The network analysis showed that these genes are well associated in three sub-networks centered on Fos, Tnf, and Ubc. PICD target genes are known for the functions of cell migration, invasion, epithelial-mesenchymal transition (EMT), and modulation of cancer microenvironment. The ability of cell invasion and migration is abolished when SPPL2b was knocked down and it is recovered by transfection of exogenous PICD (N55). Furthermore, the cells expressing Flag-tagged N55 show EMT-like scattered cellular morphology. In addition, the epithelial marker E-cadherin is decreased and mesenchymal marker Vimentin is increased in Flag-N55-expressed cells, demonstrating that PICD itself can induce EMT. The survival of estrogen receptor (ER)-negative breast cancer patients with high PRSS14 expression is poorer in the patients with high level of PRSS14 and SPPL2B. Also, ER-negative patients expressing high level of PRSS14 and PICD target genes are able to use for the good prognosis markers for ER-negative breast cancer. Therefore, these results suggest that a novel mechanism of PICD to promote cancer metastasis by increasing cell invasion and EMT and modulating cancer microenvironment through transcriptional regulation. I propose that the dual function of Prss14 plays in cancer metastasis, by affecting target gene expression with intracellular domain as well as by cleaving substrates with protease domain.

막단백질분해효소인 Prss14은 다양한 상피세포암에 과발현되어 있으며, 그것이 암의 발생과, 진행, 전이에 매우 중요한 역할을 한다는 것이 보고되어있다. Prss14은 serum, TGF-, PMA 등 다양한 자극에 의해서 ectodomain shedding이 일어나는데, 그 이후 membrane에 남겨진 N-말단단편에 대해서는 알려진 바가 없다. 본 연구에서는 Prss14이 shedding된 이후, regulated intramembrane proteolysis에 의해 잘려서 intracellular domain (PICD)이 만들어진다는 것을 밝혔다. PMA를 처리하면 TACE에 의해 Prss14의 ectodomain shedding이 일어나고 SPPL2b는 membrane에 남아있는 N-terminal fragment를 자른다. 이렇게 만들어진 PICD는 membrane에서 떨어져나와, 핵으로 이동하여 전사조절에 관여한다. RNA-sequencing에 의한 전사체분석을 통하여 PICD의 타겟유전자가 전사인자, 사이토카인, 세포의 이동과 침습에 관여하는 유전자, ubiquitin proteasome pathway에 관련된 유전자들을 포함하고 있다는 것을 밝혔다. 이들 유전자는 Fos, Tnf, Ubc 유전자들을 중심으로 기능적인 network를 이루고 있다. 또한, PICD 타겟 유전자들이 세포의 이동, 침습, epithelial-mesenchymal transition (EMT), 암 미세환경 조절을 포함한 암과 관련된 기작에 관여하고 있다는 것을 확인하였다. PICD를 발현시킨 세포에서는 EMT에서 보이는 세포의 모양이 변화가 관찰되었고, pre-EMT marker인 E-cadherin의 발현이 감소하고 post-EMT marker인 Viment의 발현이 증가하였다. 더나아가, PICD를 발현하는 세포에서는 세포의 이동과 침습성이 증가하는 것을 관찰하였다. 세포의 이동과 침습은 SPPL2b를 knockdown하여 PICD가 적게 만들어지는 세포에서는 감소해 있었으며, control 세포에서 관찰되는 PMA에 의한 세포 이동과 침습이 SPPL2b-KD 세포에서는 관찰되지 않았다. 또한 PMA를 처리하지 않아도 SPPL2b-KD 세포에 PICD만 발현시켜도 세포의 이동과 침습이 증가하는 것을 통해 세포의 이동과 침습이 PICD에 의존적으로 조절됨을 확인하였다. Prss14이 과발현되어 있으며, 과발현정도가 암의 진행과 암환자의 생존율에 관련이 있다고 알려져있는 유방암 환자에서 PICD가 만들어지는 현상의 clinical relevance를 확인하였다. 유방암 환자에서 Prss14이 높을 때 PICD 타겟 유전자들의 발현이 통계적으로 유의하게 높았다. 또한, TCGA 유방암 환자의 데이터를 이용한 생존율 분석을 통해서 SPPL2b와 PICD의 타겟유전자들이 Prss14과 함께 높게 발현될 때 ER-negative 유방암 환자에서 생존율이 크게 감소하는 것을 확인하였다. 따라서 Prss14 뿐만 아니라, SPPL2b와 PICD 타겟유전자들은 ER-negative 유방암 환자의 유용한 진단 마커로 쓰일 수 있으며 치료 타켓이 될 수 있음을 알 수 있다. 본 연구는 막단백질분해효소인 Prss14이 타겟유전자들의 전사에 관여하여 암 전이를 조절하는 새로운 기능을 밝혔고, 이 조절기작이 암 환자에게서도 중요함을 제시하였다.