Molecular Characterization of Hepatocyte Growth Factor Functions in Muscle Atrophy and Regeneration

Abstract

Hepatocyte growth factor (HGF) has been well characterized in terms of its roles in the migration of embryonic muscle progenitors and the activation of adult muscle stem cells, yet it remains unclear whether HGF affects the adult muscle regeneration process or neurogenic muscle atrophic conditions. In response to this gap in scientific knowledge, my thesis focused on investigating the roles of HGF/c-met signaling in the skeletal muscle wasting and injury-induced regeneration processes.

The first step was to test the effects of HGF on neurogenic muscle atrophy. It was found that HGF expression was upregulated in skeletal muscle tissue following surgical denervation, as well as in hSOD1-G93A transgenic mice showing severe muscle loss. Pharmacological inhibition of c-met receptors decreased the expression level of pri-miR-206 and enhanced that of HDAC4 and atrogenes, resulting in increased muscle atrophy. In C2C12 cells, HGF inhibited phosphorylation of Smad3 and relieved TGF-β-mediated suppression of miR-206 expression via JNK. When extra HGF was exogenously provided through the intramuscular injection of plasmid DNA expressing human HGF protein, the extent of muscle atrophy was reduced and the levels of all affected biochemical markers were changed accordingly, including those of primary and mature miR-206, HDAC4, and various atrogenes.

This study also investigated the roles of HGF in cardiotoxin-induced muscle regeneration. It was found that HGF/c-met signaling was activated during muscle regeneration, and that among various infiltrated cells, the macrophage was the major cell type affected by HGF. Pharmacological inhibition of the c-met receptor by PHA-665752 increased the expression levels of pro-inflammatory (M1) macrophage markers like IL-1β and iNOS while lowering those of pro-regenerative (M2) macrophage markers like IL-10 and TGF-β, resulting in compromised muscle repair. In Raw 264.7 cells, HGF decreased the RNA level of LPS-induced TNF-α, IL-1β, and iNOS, while enhancing that of IL-10. HGF was also shown to increase the phosphorylation of AMPKα through CaMKKβ, thereby overcoming the effects of the LPS-induced deactivation of AMPKα. Transfection with specific siRNA to AMPKα diminished the effects of HGF on the LPS-induced gene expressions of M1 and M2 markers. Exogenous delivery of HGF through intramuscular injection of the HGF-expressing plasmid vector promoted the transition to M2 macrophage and facilitated muscle regeneration.

Taken together, my findings suggested that HGF may play important roles in the progression of neurogenic muscle atrophy and macrophage transition during adult muscle regeneration. The results described in this thesis provide very useful information in developing innovative therapeutics based in HGF for a variety of neuromuscular disorders and muscle degenerative diseases.

간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor: HGF)는 배 (embryo) 발생과정에서의 근육 전구세포의 이동과 성체 근육 줄기세포의 활성화에 관여한다고 알려져 있다. 그러나 성체의 근육에서 HGF가 어떤 역할을 하는지는 명확히 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 HGF가 신경성 근위축 (neurogenic muscle atrophy) 과정에서 어떠한 기능을 수행하며, 근육 재생에 어떤 영향을 미치는지 조사하였다.

먼저 HGF가 신경성 근위축에 미치는 영향을 조사하였다. 마우스의 좌골신경을 절단하여 근 위축을 유도하는 sciatic nerve transection 모델과 근위축성 축삭경화증을 모방하는 hSOD1-G93A 마우스 모델의 전경골근 (TA)에서 HGF의 발현과 c-met 수용체의 인산화를 조사하였다. 그 결과 두 모델 모두에서 대조군 대비 HGF의 발현이 증가하고, c-met이 인산화 되는 것을 관찰하였다. 이때 발현이 증가한 HGF가 신경성 근 위축에 관여하는지 알아보기 위하여 c-met 수용체를 억제하는 PHA-665752를 마우스에 경구투여 하였다. 그 결과, PHA-665752를 투여한 마우스에서는 miRNA-206의 1차 전사체 발현이 감소하고, HDAC4 및 근 위축 유전자의 발현은 증가하며 근육 위축이 심화되는 것을 관찰하였다. 이에 대한 분자세포생물학적 메커니즘을 이해하기 위해 C2C12 근육세포주를 사용하였다. C2C12 세포에서 HGF는 하위 신호전달 매개자인 JNK를 통하여 TGF-β에 의해 유도되는 Smad3의 인산화를 저해하였고, 그 결과 miR-206 발현도 증가시킴을 관찰하였다. 또한 간세포 성장인자를 발현하는 플라스미드 DNA를 마우스 근육에 주사하였을 때, 이로부터 발현된 HGF 단백질이 miR-206-HDAC4 cascade를 조절하여 근육 위축을 완화함을 관찰하였다.

다음으로 간세포 성장인자가 근육 재생 과정에 미치는 영향을 연구하였다. 이를 위해 코브라 독에서 분리한 심장 독소 (CTX)를 전경골근에 투여하여 근 손상을 유도하고, 근육의 재생을 관찰하는 시스템을 사용하였다. 근육 손상 시 HGF/c-met 신호전달경로가 활성화되며, 이때 근육으로 침투한 다양한 면역세포 중 대식세포가 HGF에 의해 활성화됨을 확인하였다. PHA-665752를 마우스에 경구투여 하였을 때, 근육에서 친(親)염증성 (pro-inflammatory) 대식세포인 M1 세포의 표지자인 IL-1β와 iNOS의 발현이 증가하였고, 친(親)재생성 (pro-regenerative) 대식세포인 M2 세포의 표지자인 IL-10과 TGF-β의 발현은 감소하여 근육 재생이 지연됨을 관찰하였다. 이 과정의 분자세포생물학적 메커니즘을 이해하기 위해 Raw 264.7 대식세포주를 사용하였다. Raw 264.7 세포를 LPS로 처리할 경우, 대식세포가 활성화되어 염증성, 재생성 표지자들의 발현이 증가한다. 이때 HGF를 가하면 LPS에 의해 유도된 친-염증성 대식세포 표지자 (TNFα, IL-1β, 및 iNOS)의 유전자발현이 농도 의존적으로 감소하였고, 반면 IL-10의 유전자 발현은 증가하였다. 이때 HGF는 CaMKKβ를 하위 신호 전달 매개자로 이용하여 AMPKα의 인산화를 증가시켜 대식세포 표지자들의 유전자 발현을 조절하는 것을 밝혔다. 이러한 현상은 동물 모델에서도 관찰되었다. 즉 간세포 성장인자를 발현하는 플라스미드 DNA를 마우스 근육에 주사하였을 때 이로부터 발현된 HGF에 의하여 친재생성 대식세포로의 전이가 촉진되었으며, 근육 재생을 촉진됨을 관찰하였다.

본 연구를 통하여 HGF가 마이크로RNA 및 근 위축 유전자의 발현을 조절하여 신경성 근위축의 진행을 억제하고, 대식세포 표현형 전이에 관여하여 근육 재생을 촉진한다는 사실을 밝혔다. 이 논문에 실린 연구결과들은 신경성 근위축 및 근육 재생 과정에서 간세포 성장인자의 역할을 이해하는 데 도움을 줄 뿐 아니라, HGF를 활용하여 신경근육 질환 및 근육 퇴행성 질환에 대한 새로운 치료제를 개발하는 데 유용한 자료로 사용될 수 있을 것으로 생각된다.