세포투과 기능성 펩타이드 융합단백질에 의한 골형성 촉진효과 연구

Abstract

1. 목 적

인간성체줄기세포는 조골세포, 연골세포, 지방세포를 포함하여 다양한 세포 형태로 분화가 가능한 다분화능력 줄기세포(multipotent stem cell)이다. Runx2의 전사는 성체줄기세포가 골조직으로의 분화에 있어서 중요한 요소로 작용한다. TAZ(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif)는 Runx2 전사 과정에 작용하여 성체줄기세포의 조직분화를 유도할 수 있다는 것이 생쥐 중배엽 줄기세포 연구에서 밝혀졌다. 하지만 TAZ 단백질은 분자량이 큰 물질이기 때문에 직접 세포내로 유입이 어렵다. 그러므로 이번 실험에서는 세포 투과기능성 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP)를 사용하여 CPP-TAZ 재조합 융합 단백질을 제조하였고, 이를 통해 세포내로 유입이 가능하도록 하였다. 이번 연구를 통해 CPP-TAZ 융합 단백질을 인간성체줄기세포에 처리하였을 경우, 골조직분화 및 지방조직으로 분화여부를 관찰하고자 하였다.

2. 방 법

Cell penetrating peptide를 TAZ가 삽입되어 있는 pET21 플라스미드 벡터에 클로닝하여 재조합 단백질인 CPP-TAZ를 추출하였다. 실험은 단백질 처리를 하지 않은 실험군, TAZ 단백질을 처리한 실험군(negative control), LMWP-TAZ 융합단백질을 처리한 실험군, Bone morphogenetic protein-2(BMP-2) 단백질을 처리한 실험군(positive control)의 4 그룹으로 나누어 진행하였다. 성체줄기세포 내로 CPP-TAZ 단백질의 유입은 유세포 측정기 분석(FACS analysis)과 공초점 현미경(confocal microscopy), TAZ 항체를 이용한 웨스턴 블랏(western blot)을 사용하여 확인하였다. 성체줄기세포의 골모세포로 분화는 융합단백질을 처리한 후 7일 동안 세포배양 후에 ALP(alkaline phosphatase) 염색법과 14일 동안 세포배양 후 Alizarin S 염색법 그리고 RT-PCR을 이용하여 확인하였다. 성체줄기세포의 지방세포로 분화는 융합단백질을 처리한 후 10일 동안 세포배양 후에 Oil red O 염색법과 RT-PCR을 통해 CPP-TAZ 융합단백질이 지방세포 분화에 어떤 영향을 미치는지 확인하였다.

3. 결 과

CPP-TAZ 융합단백질이 성체줄기세포내로 유입되는 것을 확인 할 수 있었고, CPP-TAZ 융합단백질이 성체줄기세포의 분화 과정에 작용하여 성체줄기세포를 지방조직이 아닌 골조직으로 분화를 촉진시키는 경조직 형성능이 있다는 것을 확인 할 수 있었다.

1. Objectives

Human mesenchymal stem cells(hMSCs) are multipotent stem cells that can differentiate into a variety of cell types, including: osteoblasts (bone cells), chondrocytes (cartilage cells) and adipocytes (fat cells). The transcription of Runx2 plays a critical role for osetoblastic differentiation of hMSCs. The TAZ(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif) coactivates Runx2-dependent gene transcription while repressing PPARγ-dependent gene transcription and modulates osteogenic differentiation in mouse MSCs. But TAZ itself cannot penetrate through the cell membrane directly because of its large molecular weight. In this study, TAZ was applied to the cells directly using the cell penetrating peptides(CPPs). We carried out this study to observe how the CPP-TAZ fusion protein has an effect on the osteoblast and adipocyte differentiation of hMSCs.

2. Methods

CPP-TAZ was prepared by E. coli overexpression system using a pET21b vector. The CPP-TAZ fusion proteins were not toxic to the cells and were efficiently transferred into hMSCs. These were proven through the western blotting method using TAZ antibody, the fluorescence-activated cell sorting(FACS) methods and a direct detection of transferred cell with the confocal microscope. The ALP(alkaline phosphatase), Alizarin red S staining and semi-quantitative RT-PCR was used to confirm the potency to differentiate into osteogenic lineage. The Oil red O staining and semi-quantitative RT-PCR was used to test the capacity to differentiate into adipocyte lineage.

3. Conclusion

We confirmed that CPP-TAZ fusion protein has an ability to internalize into the hMSCs and differentiate hMSCs into the cells producing minerals, which is done by the so-called osteogenic differentiation. In addition, CPP-TAZ inhibited the adipogenic differentiation confirmed by down regulation of adipogenic gene marker. These results revealed that the internalization of TAZ using CPP not only induced osteogenic differentiation but also inhibited adipogenic differentiation. This is suggesting that CPP-TAZ might be served as a bioactive material for bone regeneration procedures.