PI3K as a molecular target of cancer prevention, anti-proliferation, and anti-metastasis with Piceatannol, Cyanidin, Licochalcone A, and Isoangustone A

Abstract

The phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt signaling pathway and its downstream have been intensively studied for their role in cell survival, cell proliferation, cell differentiation, cell motility, as well as other cellular functions. There is growing evidence showing that dysregulation of this pathway also plays an essential role in various diseases, including diabetes, autoimmunity, and especially cancer. Because administration of standard synthetic chemotherapy agents is usually associated with at least mild toxicity, the possible use of non-toxic, natural compounds to target the PI3K/Akt pathway is attractive for cancer prevention. Tumor metastasis is one of the most threatening features of the oncogenic process and the main cause of death in cancer patients. Many studies have demonstrated that matrix metalloproteinases (MMPs) are critical for tumor invasion and metastasis. Resveratrol, a phenolic compound of red wine, has been reported to be a natural chemopreventive agent. However, the cancer-preventive and anti-metastatic effects of piceatannol, a metabolite of resveratrol, and the underlying molecular mechanisms are still not understood. Here we report that piceatannol inhibited H-ras-induced MMP-2 activity and invasive phenotypes more strongly than resveratrol did in MCF10A human breast epithelial cells (H-ras MCF10A cells). Piceatannol time- and dose-dependently attenuated H-ras-induced phosphorylation of Akt, whereas resveratrol did not exert an inhibitory effect when tested at the same concentrations. In vitro kinase assays demonstrated that piceatannol strongly inhibited phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) activity and also suppressed PIP3 expression in H-ras MCF10A cells. Ex vivo pull-down assays revealed that piceatannol directly bound with PI3K to inhibit PI3K activity. Docking data suggested that piceatannol can be a more tightly binding inhibitor than resveratrol due to the additional hydrogen bond between the hydroxyl group and the backbone amide group of Val882 in the ATP-binding pocket of PI3K. Cyanidin, an anthocyanidin found in red wine and fruits, has been reported to possess anticancer effects. However, there is no study on the chemopreventive effect of cyanidin against neoplastic cell transformation and its molecular mechanisms. In the present study, we compare the anti-carcinogenic effects of cyanidin and cyanidin-3-glucoside (C3G) and investigate their underlying mechanisms. The inhibitory effect of cyanidin on EGF-induced cell transformation was higher than those of C3G in JB6 P+ mouse epidermal (JB6 P+) cells. Both cyanidin and C3G showed dose-dependent radical scavenging activities. It is indicated that the divergent inhibitory effects of cyanidin and C3G are not due to their antioxidant activities. We found that cyanidin, but not C3G, inhibited the EGF-induced Akt/p70S6K phosphorylation. Moreover, cyanidin directly suppressed the activity of PI3K by binding to PI3K directly in an ATP-competitive manner, which indicates that PI3K is one of the molecular targets of cyanidin. Licorice is a traditional herbal medicine originated from the licorice root, and it remains one of the most commonly prescribed botanicals in Asia for treatment of various diseases. Glycyrrhizin (Gc), a triterpene compound, the most abundant constituent of licorice. However, a high intake or a long-term consumption of Gc causes several side effects such as hypertension. Therefore, it is worth finding another active compound in licorice, not Gc, which has a anti-carcinogenic effect. Licochalcone A (LicoA) is a major chalcone isolated from the root of licorice. There is no study on the chemopreventive effect of LicoA against solar UV-induced COX-2 expression and its molecular mechanisms. Here, the present study showed that Licochalcone A (LicoA), a major chalcone compound of licorice, effectively inhibits solar UV-induced COX-2 expression and PGE2 generation through the inhibition of AP-1 transcription activity more strongly than Gc. Western blotting data showed that LicoA suppresses solar UV-induced phosphorylation of Akt/mTOR and ERK1/2/p90RSK in HaCaT cells. Moreover, LicoA directly suppresses the activity of PI3K, MEK1, and B-Raf, but not Raf-1, indicating that PI3K, MEK1, and B-Raf are the molecular targets of LicoA. We also found that LicoA binds to PI3K in an ATP competitively manner, but LicoA does not compete with ATP for binding with MEK1. Our data indicated that PI3K, MEK1, and B-Raf are the molecular targets of LicoA. We also found that Isoangustone A (IAA), a novel flavonoid from licorice roots, suppressed cell proliferation of SK-MEL-28 human melanoma cells. It significantly blocked cell cycle progression of cells at the G1 phase and also inhibited the expression of G1 phase-regulatory proteins, including cyclin D1, CDK4, cyclin E, and CDK2. As shown by Western blot, IAA suppressed the phosphorylation of Akt/GSK3ß and JNK1/2/c-Jun pathway and subsequently attenuating the expression of cyclin D1. IAA also bound to PI3K, MKK4, MKK7, and strongly inhibited their kinase activities in an ATP-competitive manner. Moreover, in a xenograft animal model, IAA significantly decreased the tumor growth, tumor volume, and tumor weight of SK-MEL-28 xenografts. Collectively, these results suggest that PI3K, MKK4, and MKK7 are the primary molecular targets of IAA in the suppression of cell proliferation. These insights into the biological actions of IAA provide a molecular basis for the possible development of new anti-carinogenic agents. Taken together, these results indicate that PI3K is the potent molecular target of piceatannol and cyanidin during neoplastic cell transformation and breast cancer metastasis, respectively. PI3K, MEK1, and B-Raf are the molecular targets of LicoA in the inhibition of skin cancer. PI3K, MKK4, and MKK7 are the molecular targets of IAA in the suppression of human melanoma cell proliferation. These results provide insight into the biological actions of piceatannol, cyanidin, LicoA, and IAA and their molecular basis for the development of new chemoprotective agents.

세포의 증식, 세포 분화, 세포 이동 등과 같은 여러 세포 기능들에 대한 Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt 신호전달 체계와 그 하위 신호전달의 역할은 현재까지 많은 연구가 되어있다. 비정상적인 PI3K/Akt 신호전달의 과도한 활성은 당뇨, 자가면역, 특히 암과 같은 다양한 질병에 관여한다는 많은 연구가 보고되어 있다. 일반적인 합성 암 예방 및 치료 물질들은 일반적으로 독성과 관련된다고 알려져 있으므로 상대적으로 독성이 없고 안전하다고 알려진 천연소재들 중 PI3K/Akt를 표적으로 하는 암예방 물질을 찾는 것이 중요하다. 암의 전이는 암환자들 사망의 가장 큰 원인으로 가장 위험한 암의 특징이다. 단백질 가수분해 효소인 MMPs (Matrix Metalloproteinases)는 암의 침윤과 전이에 가장 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 포도주의 성분 중 하나인 레즈베라트롤 (Resveratrol)은 천연 암 예방 성분으로 알려져 있다. 하지만 레즈베라트롤의 대사체인 피스에탄올 (Piceatannol)에 대한 항전이 효능 및 작용 기작은 잘 알려져 있지 않다. 본 연구에서 피스에탄올은 레즈베라트롤 보다 더 강하게 H-ras에 의해 유도된 유방암에서의 MMP-2 활성 저해와 침윤 및 이동 저해 능력을 가지고 있음을 확인하였다. 피스에탄올은 시간의존적, 농도의존적으로 레즈베라트롤 보다 더 효과적으로 H-ras에 의해 유도된 Akt 인산화를 저해하였다. In vitro PI3K kinase assay를 통하여 피스에탄올이 PI3K 활성을 강하게 저해함을 확인하였고, H-ras MCF10A 인간 유방 세포를 이용한 ex vivo 실험에서도 피스에탄올이 PIP3의 발현을 저해함을 확인하였다. Ex vivo pull down assay를 통하여 피스에탄올이 PI3K와 직접 ATP 경쟁인 경향으로 결합한다는 것을 확인하였다. 과일이나 채소 및 포도주 등에 함유된 안토시아닌 종류 중 하나인 시아니딘(Cyanidin)은 항암효능을 지녔다고 알려져 있다. 하지만 세포 악성 변형과 그에 대한 기작에 대한 시아니딘의 암 예방 효능 연구는 이루어지지 않았다. 본 연구에서는 시아니딘과 시아니딘-3-글루코시드 (Cyanidin-3-glucoside, C3G)의 항암 효능을 비교하고 관련 기작을 살펴보았다. JB6 P+ 세포에서 EGF에 의해 유도된 세포 악성 변형을 시아니딘이 C3G보다 더 많이 저해시킴을 확인하였다. 시아니딘과 C3G 모두 농도의존적으로 자유라디칼 소거 활성을 보였고, 이는 두 물질의 세포 악성 변형 저해 효능 차이가 항산화능력에서 오는 것이 아님을 의미한다. 시아니딘은 C3G와 다르게 EGF에 의해 유도된 Akt/p70S6K의 인산화를 저해하였다. 또한 시아니딘은 ATP 경쟁적으로 PI3K와 결합하여 그 kinase 활성을 저해시킴을 확인하였다. 이 것은 PI3K가 시아니딘의 분자 표적이며, PI3K활성을 저해시킴으로서 세포 악성 변형을 막는다고 할 수 있다. 감초는 감초 뿌리로부터 기원한 전통적인 한방 물질이고, 여러 가지 질병 치료를 위해 동양에서 가장 많이 사용되는 한방 처방이다. 글리시린진 (Glycyrrhinzin, Gc)은 triterpene 물질로서 감초에서 가장 많이 함유된 성분으로 알려져 있다. 하지만 높은 농도 또는 장기간 섭취는 고혈압을 비롯한 여러가지 부작용을 야기한다. 따라서 Gc가 아닌 다른 감초 성분의 항암 효능을 밝히고 찾는 연구가 필요하다. 리코찰콘 A (Licochalcone A, LicoA)는 감초 뿌리에 있는 가장 주된 chalcone구조의 파이토케미컬 물질이다. 현재까지 자외선에 의해 유도된 COX-2 발현 저해에 대한 리코찰콘 A에 효능과 그 작용 기작 연구는 이루어지지 않았다. 본 연구에서는 리코찰콘 A가 자외선에 의해 유도된 COX-2 발현 및 PGE2 생성을 AP-1 활성 저해를 통하여 감소시키고, Gc보다 강하게 저해시킨다는 것을 확인하였다. Western blotting 결과를 통하여 인간 keratinocyte인 HaCaT세포에서 리코찰콘 A가 자외선에 의해 유도된 Akt/mTOR, ERK1/2/p90RSK 인산화를 저해시킴을 확인하였다. 또한 리코찰콘 A가 그 상위 분자인 PI3K, MEK1, B-Raf의 kinase와 직접적으로 결합함으로서 그 활성을 저해함을 확인하였다. 또한 리코찰콘 A가 PI3K와 B-Raf와는 ATP경쟁적으로 결합하고, MEK1과는 ATP 비경쟁적으로 결합함을 확인하였다. 이 결과들을 통하여 리코찰콘 A의 분자표적은 PI3K, MEK1, B-Raf kinase라는 것을 도출할 수 있다. 감초 뿌리에서 동정한 감초의 새로운 성분인 이소안구스톤 A (Isoangustone A, IAA)는 인간 악성 흑색종 세포의 증식을 저해한다는 것을 세포실험과 동물실험을 통해 확인하였다. 이소안구스톤 A는 암세포의 비정상적인 세포주기의 G1 phase에서 중지시킨다는 것을 확인하였고, cyclin D1, CDK4, cyclin E, CDK2와 같은 G1 phase와 관련된 단백질들의 발현 또한 저해시킴을 확인하였다. 이소안구스톤 A는 Akt/GSK3ß, JNK1/2/c-Jun 인산화를 저해시켰고, 이 신호전달 체계를 저해함으로서 cyclin D1의 발현을 저해시켰다. 이소안구스톤 A는 또한 맛와 JNK1/2의 상위 조절 인자인 PI3K, MKK4, MKK7의 kinase 활성을 저해시키고, 이는 이소안구스톤 A가 ATP경쟁적으로 위의 세 가지 kinase와 결합함으로서 이루어진다는 것을 확인하였다. 이상의 연구결과는 피스에탄올, 시아니딘이 이들의 분자 지표인 PI3K를 직접적으로 타겟하여 유방암 전이 및 세포 악성 변형을 저해한다는 것을 나타낸다. 리코찰콘 A는 PI3K 뿐만 아니라 MEK1, B-Raf를 함께 타겟함으로서 자외선에 의해 유도된 COX-2 발현 저해 및 암예방 효능을 가진다는 것을 확인하였다. 또한 이소안구스톤 A는 PI3K, MKK4, MKK7을 함께 타겟함으로서 인간 흑색종 증식을 억제한다는 것을 확인하였다. 이러한 결과들은 피스에탄올, 시아니딘, 리코찰콘 A, 이소안구스톤 A의 암 예방 및 항암 활성에 대한 직접적인 분자기전을 규명한 것으로 새로운 암 예방 및 항암 소재로서의 기초를 마련해 줄 수 있음을 제시한다.