Functional analysis of human genes by cell-based, high-throughput assay

Abstract

The Human Genome Project (HGP), a huge project as a milestone of bioscience defined the structure and sequence of whole human genome. Functional genomics studies have drawn great attention after completion of HGP, however, genome-wide studies have been hampered by lack of suitable gene delivery systems in mammalian cells. In fact, efficient high-throughput gene delivery system in mammalian cells is necessarily needed for functional genomics studies and drug discovery programs. In the present studies, I attempt to develop a high-throughput gene delivery system into mammalian cells using recombinant adenovirus. By combining Gateway-based site-specific recombination with terminal protein-coupled adenovirus vector, the adenovirus high-throughput system (AdHTS) generates multiple recombinant adenoviruses in 96-well plates simultaneously without additional cloning or recombination in bacteria or mammalian cells. The AdHTS allows a rapid and robust cloning and expression of genes in mammalian cells by removing shuttle vector construction, bacterial transformation and plaque isolation. By shortening the time required to convert whole cDNA collection into desired viral vector constructs, the AdHTS would contribute to functional genomics and proteomics studies in various mammalian systems. I used the entry clones of G-protein coupled receptors for a model study. I generated 120 adenoviruses containing GPCRs in intact and GFP-fused form at C-terminal end. The functional activity of the GPCRs was analyzed by β arrestin mediated internalization of GPCR following treatment of agonist. The expression and functionality were well reproduced as expected. Moreover, as a part of effect to elucidate the protein-protein interaction of GPCR, I employed a bimolecular fluorescence complementation (BiFC) technology. For the study of GPCR dimerization, 164 GPCRs viruses were generated in VN and VC-tagged forms (N- and C-terminal of Venus, an enhanced version of yellow fluorescence protein) in 96-well format. For instance, to investigate whether the neurotensin receptor 1 (NTSR1) forms the heterodimer with other GPCRs, NTSR1-VN and 164 other GPCRs-VC viruses were co-infected and analyzed by using BiFC assay. It was found that NTSR1 forms heterodimers with somatostatin receptors 2 (SSTR2), opioid receptor like receptor 1 (OPRL1) and leukotriene receptor 4 (LTB4R) independently. This result suggests that neurotensin receptor 1 can interact with other GPCRs leading to different roles in signal transduction pathways.

Keywords: recombinant adenovirus, Gateway cloning, GPCR; G protein coupled receptors, BiFC; bimolecular fluorescence complementation, heterodimer, neurotensin, NTSR1; neurotensin receptor 1

Student number: 2003-30118

본 연구는 고속유전자전달이 가능한 새로운 유전자 전달체를 개발하고, 다수의 G 단백 연결 수용체 (GPCR)를 고속으로 발현하여 그 기능을 연구할 수 있으며, 이분자 형광상보 기술 (BiFC, Bimolecular Fluorescence Complementation)을 활용하여 GPCR 이합체 형성 (Dimerization)에 대한 연구를 수행함으로써, 고속유전자발현을 통한 새로운 단백질 기능연구 방법론을 제시하고자 한 것이다. 인간 유전체 프로젝트를 통해 막대한 양의 유전체 및 유전자 정보가 밝혀짐에 따라 기존의 연구방법과는 전혀 다른 새로운 패러다임의 연구방법론이 제기 되었다. 이른바 오믹스 (omics)의 시대가 도래한 것으로, 개별 유전자의 발현 및 기능연구에서 동시에 대량의 유전자들의 기능을 밝혀나가는 형태의 유전체 및 단백체 연구가 본격적인 연구의 흐름으로 자리잡게 되었다. 더욱이 수많은 유전자가 발굴됨에 따라 다수의 유전자를 동시 다중적인 방법으로 기능을 연구할 수 있는 고속유전자발현 (high-throughput gene expression) 기술의 필요성이 강하게 대두되었다. 이를 위해 전체 인간유전자 21,000 여종의 전장유전자를 물리적인 클론으로 확보하고 이를 학계에 공급하고자 하는 다수의 유전자 확보 사업 (gene collection project) 들이 출범하였다. 현재까지 MGC, FLEXGene repository, ORFeome 사업을 통해 인간유전자의 90% 이상을 Gateway, Cre/lox 및 발현벡터 형태로 확보하였고, 단백질 발현 실험을 통한 단백질의 기능연구의 길이 열리게 되었다. 고속유전자 발현연구에 있어서 가장 큰 제약은 확보된 전장유전자를 발현하고 기능을 탐색할 수 있는 발현벡터로 옮기는 클로닝 과정이다. 또한 발현된 단백질의 기능을 연구하기 위해서는 발현되는 단백질의 종류에 관계없이 특정한 기능을 탐색할 수 있는 같은 센서가 요구된다. 단백질은 생체 내에서 다른 단백질, 핵산 및 지질 등과 상호작용을 통해 기능을 하게 되는데, 특정 단백질간의 상호작용을 확인한다면, 단백질 기능연구의 중요한 단서가 될 수 있다. 최근 들어 단백질 상호작용을 탐색할 수 있는 이분자 형광상보 기술을 많이 사용하고 있는데, 이는 실시간 추적이 가능하고, 추가로 시약 등을 넣어주지 않아도 되는 장점이 있기 때문이다. 이 때문에 BiFC 기술이 고속유전자 발현 및 기능연구에 있어서 강력한 센서가 될 수 있다. BiFC 분석을 위해서는 목적 유전자를 형광단백질의 N 말단과 C 말단의 융합형태로 클로닝해야 하기 때문에 단백체 수준의 연구에 있어서 제약요인이 되고 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해서, 포유동물에서 사용되는 유전자 전달기술 중에서 조직특이성이 광범위하고, 외래유전자 전달율과 발현율이 높은 아데노바이러스 기술을 선택하였고, 재조합 바이러스 생성효율을 고속화 가능한 수준으로 개선하고자 하였다. 이를 위해 아데노바이러스의 말단단백질(terminal protein) 기술과, 공용 클론(public clones)을 이용하여 클로닝 과정을 생략할 수 있도록 Gateway 재조합 기술을 도입한 아데노바이러스 벡터를 개발하였다. 또한 BIFC 분석을 통해 단백질 상호작용 연구를 할 수 있는 Ad-BiFC 센서를 구축함으로써, 기존의 공용클론으로부터 곧바로 재조합 아데노바이러스를 고속으로 생산할 수 있는 기술을 완성하였다. 개발된 재조합아데노바이러스 전달체를 활용하여, GPCR의 발현 및활성 측정, 그리고 이합체 형성에 관한 연구를 수행하였다. GPCR은 대표적인 약물 표적인 막단백질 그룹으로 최근 들어 그 이합체 형성이 생물학, 생리학 및 약학적 관점에서 주목을 받고 있다. 형광상보분석을 위해 164종의 GPCR 유전자를 황색 형광단백질의 변종 비너스의 N말단 C 말단으로 결합된 형태의 각각 GPCR-VN과 GPCR-VC 재조합 바이러스를 제조하였다. GPCR의 일종인 뉴로텐신 수용체 1 (NTSR1)은 뇌와 소장에 분포하는 뉴로텐신의 수용체로서 신경전달의 조절, 통증 및 식욕의 조절 및 세포의 성장 및 소화에 관여하는 뉴로텐신의 기능을 매개한다. NTSR1과 다른 GPCR의 이합체 형성 여부를 탐색하기 위해서 NTSR1-VN과 164종 GPCR 그리고 NTSR1-VC와 164종 GPCR을 각각 동시 감염하여 BIFC 분석을 하였다. 그 결과 NTSR1은 보고된 바와 같이 homodimer를 형성할 뿐만 아니라, SSTR2 (somatostatin receptor 2), OPRL1 (opioid receptor like receptor 1) 및 LTB4R (leukotriene receptor 4)와 heterodimer를 형성하는 것을 확인하였다. 형성된 dimer는 각각의 ligand(agonist)에 의해 활성화되어 세포 내로 함입되어 알갱이(granule)을 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 위 연구결과는 뉴로텐신 수용체인 NTSR1이 GPCR들과 이합체를 형성함으로써 뉴로텐신의 기능을 매개할 수도 있음을 시사한다고 사료된다.

주요어: 아데노바이러스, Gateway 클로닝, 이분자형광상보, G-단백연결수용체, 뉴로텐신, 뉴로텐신수용체1

학 번: 2003-30118