Generation and preservation of genome edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein

Abstract

Rats are major laboratory animals for biomedical research. They are easy to handle and have similar physiological characteristics like humans. However, mouse was preferred animal for the studies of gene function and the development of genetically modified animals for a long time. Currently, the importance of developing genome engineered rat has been increased because of their physiological advantages. In this study, to efficiently produce and preserve genome engineered rats, three parts of producing genome edited rats (superovulation, gene editing, and embryo freezing) were investigated. Firstly, superovulation is an essential technique to increase the possibility to produce genome engineered embryos. Commonly, a combination of equine chorionic gonadotropin and human chorionic gonadotropin has been used for a conventional method to induce superovulation. However, for increasing the ovulated oocytes, inhibin anti-serum was used to regulate the secretion of follicle stimulating hormone at pituitary gland. Immature Sprague Dawley rats were injected inhibin anti-serum (200 ul vs 500 ul) by two administration ways (Intravenous; IV vs intraperitoneal; IP). As a result, the highest number of collected zygotes was obtained at 500 ul IP group aged at 3-week-old. Secondly, PRNP gene encoding prion protein was targeted to produce PRNP knock out rats mediated by CRISPR/Cas9. To increase the efficiency of genome engineering, Cas9 protein and guide RNA were introduced into zygotes by electroporation. After electroporation, 2-cell stage embryos were transferred to recipient females and some pups were produced. Genomic DNA of produced pups was isolated, and genotyping analysis was performed. As a result, insertions and deletions were observed at targeted loci. Further, different embryo freezing methods (slow freezing and vitrification) were applied to preserve the generated genome engineered rats. To compare the efficiency of freezing methods, 2-cell stage embryos were cryopreserved by both methods. Additionally, after freezing-and-thawing, thawed embryos were cultured in vitro for development to blastocyst stage and, both the development rate and the number of nucleus at blastocyst stage were observed. As a result, thawed embryo recovery rate was higher at slow freezing group. Also, 2-cell stage embryos of PRNP knock out rats were cryopreserved by slow freezing method. After thawing, embryos were transferred to recipient females and two pups were successfully generated. Produced pups showed normal heath condition and had the same genetic sequences as donor. In conclusion, three technical parts were improved to produce and maintain PRNP KO rats. In the future, generated genome engineered rats could be utilized to investigate the function of PRNP gene and mechanism of prion disease. Also, these results could be helpful to development of genome engineering techniques and production of genetically modified animals.

유전자 교정 동물은 유전 질환 연구와 치료제 개발을 위해서 중요한 자원으로 활용된다. 랫드는 사육이 용이하고, 짧은 번식 주기를 가지며, 많은 수의 산자를 생산하고, 마우스와 비교하여 사람과 생리학적 유전학적으로 유사하다는 장점이 있다. 본 연구에서는 보다 효율적으로 유전자 교정 랫드를 생산하기 위하여, 과배란, 유전자 교정, 및 수정란 동결 단계로 나누어서 실험을 수행하였다. 유전자 교정 랫드를 만들기 위해 첫번째로 마우스의 과배란에 사용되는 인히빈 항 혈청 주사제를 용량 (200 μl 또는 500 μl)과 주사 방법 (복강내 주사 또는 미정맥 주사)을 다르게 설정하여 미성숙 랫드 (21일 - 27일령 또는 28일 - 32일령)에 주사하여 배란된 수정란의 개수를 확인하였다. 그 결과, 21일 - 27일령 군에서 500 μl 복강내 주사 군에서 유의미한 정도의 수정란 수의 증가가 관찰되었다. 랫드의 프리온 질환 모델 생산을 위하여 PRNP 유전자를 목표로 설정하였다. 표적 위치를 선별하고 그 위치에 특이적으로 교정하기 위해 CRISPR/Cas9 유전자 가위를 수정란 내에 Electroporation 방법으로 주입하였다. 그 결과, 대리모에 2세포기 수정란을 이식하여 3마리의 산자들을 얻을 수 있었다. 태어난 산자들의 꼬리에서 추출된 DNA를 이용하여 유전자형을 분석하여, 표적 위치의 염기 서열 변화가 관찰되었다. 또한, 정상적인 생식 능력을 보유하여서 다음 세대로의 유전자형 전달이 가능하였다. 생산된 동물을 효율적으로 보존하기 위하여 수정란 동결 기술을 적용하여 보았다. 완만 동결 방법을 사용하여 적절한 수정란 동결이 가능한지 확인하기 위하여, 야생형 랫드를 과배란 후 2 세포기 상태의 수정란을 기존에 사용하였던 제작된 배지를 사용하여 동결하였다. 또한, 시판되는 배지를 사용하여 급속 동결 또한 진행하였다. 동결란은 해동 후 실험실 내에서 배양하여 배반포 단계까지 배양 후 그 발달 비율과 핵 수를 확인하였다. 그 결과 완만 동결을 사용한 군에서 보다 높은 배반포의 핵 수가 확인되었다. 또한, PRNP 유전자 위치 교정 랫드의 2 세포기 단계의 수정란을 완만 동결하여 동결란을 해동 후 대리모에 이식하여 산자를 생산할 수 있었다. 태어난 산자는 정상적인 신체 발달을 보였으며, 공여 개체와 동일한 유전자형이 확인되었다. 결론적으로, 본 연구에서는 PRNP 유전자 위치 교정 랫드를 생산하고 보존하기 위하여 필요한 기술을 세가지 부분으로 나누어서 실험을 진행하였으며, 그 결과 효율적으로 목표 동물을 생산할 수 있었다. 앞으로, 생산된 동물을 활용하여 프리온 신경 질환과 관련된 연구를 진행할 수 있을 것이다. 또한, 이 기술은 다양한 형태의 유전자 조작과 유전자 교정 동물을 생산하는데 응용될 수 있을 것이라 기대한다.