JAK-STAT signaling in breast cancer cell regulates paclitaxel sensitivity by tumor micro-environment interactions

Abstract

유방암은 전 세계적으로 여성암 중 가장 높은 비율을 차지하고 있으며, 한국에서는 유방암의 발병률이 해마다 꾸준히 증가하고 있다. 삼중 음성 유방암 은 여러가지 아형 유방암 중 가장 악성이며 치료하기가 가장 어려운 유형이다. 다른 아형 유방암에서는 호르몬 요법을 통해 estrogen 수용체, progesterone 수용체, 그리고 HER2 수용체 중 하나를 표적으로 하여 치료하지만, 삼중 음성 유방암의 경우 이러한 수용체 분자가 존재하지 않기 때문에 치료가 어려우며 보통 항암치료를 동반하게 된다. 파클리탁셀은 유방암의 치료에 대표적인 항암제 중 하나이지만, 항암치료를 하는 과정에서 파클리탁셀에 대한 내성을 획득하기도 하며, 이러한 항암제에 대한 내성은 유방암의 치료에 있어 여전히 큰 문제 중 하나이다. 따라서 본 연구는 삼중 음성 유방암에서 어떠한 기작으로 파클리탁셀에 대한 내성이 발생하는지를 알아보기 위해 7가지 삼중 음성 유방암 환자유래조직 모델을 이용하여 파클리탁셀에 대한 반응성을 평가하였다. 각각의 삼중 음성 유방암 환자유래조직 모델들은 대조군과 파클리탁셀 투여군으로 구성되었고, PBS 또는 파클리탁셀을 15mg/kg으로 4주간 복강 내 주사로 투여한 후 파클리탁셀에 대한 종양크기의 감소율을 비교 분석하였다. 상대적으로 파클리탁셀에 의한 반응성이 적은 4가지 삼중 음성 유방암 환자유래조직 모델을 파클리탁셀 저항성 군으로 정하였고, 파클리탁셀에 의한 반응성이 큰 3가지 삼중 음성 유방암 환자유래조직 모델을 파클리탁셀 반응성 군으로 정하였다. 그리고 파클리탁셀 저항성 군과 파클리탁셀의 반응성 군의 전사체와 유전체 시퀀싱 분석을 통해 어떠한 유전자들의 발현 차이를 비교분석 하였다. 그 결과 파클리탁셀에 저항성을 가지는 군에서 JAK-STAT pathway와 관련된 유전자의 발현이 파클리탁셀에 반응성을 가지는 군들에 비해 상대적으로 증가되어 있는 것을 확인하였다. 따라서 JAK-STAT pathway의 활성에 의해 파클리탁셀에 저항성을 가질 것이라는 가설을 세웠다. 따라서 파클리탁셀 저항성을 가지는 군의 종양과 파클리탁셀 반응성을 가지는 군의 종양에서 단백질을 추출하여 JAK-STAT pathway와 관련된 단백질들의 발현량과 이들의 활성을 비교 분석하였다. 그 결과 전사체 시퀀싱 분석의 결과와 유사하게 단백질 수준에서도 JAK-STAT pathway 관련 단백질들의 발현량이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이를 유방암 세포에 적용시키기 위해, qPCR와 western blot을 통해 JAK-STAT pathway가 활성이 되어 있는 삼중 음성 유방암 세포들을 선별하였다. 그리고 선별된 삼중 음성 유방암 세포들에서 JAK1과 JAK2의 저해제인 룩소리티님과 파클리탁셀을 동시에 처리하여 상승효과를 확인하였으며, 또한 JAK2를 siRNA를 이용하여 발현을 억제하였을 때, 파클리탁셀에 의한 항암작용이 증가되는 것을 확인하였다. 따라서 삼중 음성 유방암에서 JAK-STAT pathway의 활성이 파클리탁셀의 반응성에 영향을 미치는 것을 알 수 있었다. 그리고 JAK-STAT pathway는 종양 이외에 종양 주변의 미세환경에 영향을 준다는 기존의 연구결과가 많이 보고되었다. 따라서 JAK-STAT pathway가 종양 주변 미세환경에 어떠한 영향을 주는지 알아보기 위하여, 마우스의 DEG를 분석하였을 때, cell cycle과 관련된 유전자들의 발현량이 파클리탁셀 저항성을 가지는 군에서 증가되어 있는 것을 알 수 있었다. 그리고 면역염색을 통해 파클리탁셀 저항성을 가지는 종양 주변의 미세환경을 구성하는 fibroblast와 endothelial cell에서 세포증식이 증가하는 것을 확인하였다. 또한 JAK2가 억제된 conditioned media에서 키운 마우스의 fibroblast의 증식이 억제되는 것을 확인하였다. 따라서 삼중 음성 유방암에서 JAK-STAT pathway의 활성이 종양 주변의 미세환경 구성하는 fibroblast 또는 endothelial cell과 같은 세포들의 증식을 조절함으로써 파클리탁셀에 대한 반응성에 영향을 준다는 것을 알 수 있었다. 이를 바탕으로 파클리탁셀에 내성이 있는 삼중음성 유방암의 잠재적인 치료의 가능성을 제시하였다,

Breast cancer is consistently the cancer type that makes up the highest proportion of cancers in women worldwide. Triple negative breast cancer (TNBC) is the most malignant and difficult to treat. Although most hormone therapies target one of three receptors in other breast cancer subtypes, TNBC does not have any targeting molecule. Therefore, triple negative breast cancers (TNBCs) often require chemotherapy. Paclitaxel is a well-known chemotherapeutic agent for breast cancer, but patients often acquire resistance to paclitaxel during chemotherapy. To understand the mechanism of paclitaxel resistance that occurs in TNBC tumors, response to paclitaxel experiment was performed using seven xenograft models derived from patients with TNBC in-vivo . For each TNBC PDX model, 10 mice were intraperitoneally injected with either PBS (Vehicle) or paclitaxel (15 mg/kg) for 4 weeks. Of the seven PDX models, the four that did not experience a reduction in tumor size by paclitaxel were designated as the paclitaxel-resistant group. The three PDX models whose tumor sizes were significantly reduced by paclitaxel were designated as the paclitaxel-sensitive group. Then, transcriptome sequencing data from both groups were analyzed. JAK-STAT pathway-related genes were identified among the many genes with increased expression levels in the paclitaxel-resistant group compared to the paclitaxel-sensitive group. Therefore, the correlation between the upregulation of the JAK-STAT pathway and paclitaxel resistance was the focus of this study. It was further observed that paclitaxel and ruxolitinib (JAK1/JAK2 inhibitor) combination treatment in five TNBC cell lines has a synergistic effect on anti-cancer activity. When JAK2 gene knockdown by JAK2 siRNA occurred in four TNBC cell lines in vitro, JAK2 inhibition TNBC cell lines were found to be more sensitive to paclitaxel. Additionally, the paclitaxel-resistant tumors upregulated the cell cycle-related genes in the tumor microenvironments. Therefore, tumor microenvironments, such as fibroblasts and endothelial cells, were found to have upregulated proliferation in the tumors of mice in the paclitaxel-resistant group. And it was confirmed that proliferation decreased in fibroblasts incubated in CM extracted from JAK2-inhibited TNBC cell lines. The results of this study demonstrate that paclitaxel resistance in TNBC is correlated with various genomic changes and the upregulation of the JAK-STAT pathway. Further studies are essential to clarify the mechanistic pathways of the JAK-STAT pathway correlated with paclitaxel resistance.