Functional studies of PHF6 in trophectoderm differentiation

Abstract

Epigenetic regulation is important for lineage determination during early development in mammal. In early development, expression of specific transcription factors plays an important role in differentiation of cells into different lineages, such as endoderm, mesoderm, ectoderm, and trophectoderm. For lineage specification, histone modification patterns are dramatically reiwired on the lineage-specific genes to regulate their expressions. To date, transcription factor network guiding to trophectoderm determination has been studied. However, the mechanism by which epigenetic state is reprogrammed on the trophectodermal genes was poorly understood. Here, I identified Plant Homeodomain Finger 6 (Phf6) is crucial for transcriptional activation of several genes including caudal homeodomain transcription factor 2 (Cdx2), during trophectoderm differentiation. Importantly, PHF6 possesses intrinsic E3 ubiquitin ligase activity on histone H2BK120 for transcriptional activation. PHF6 recognizes H2BK12 acetylation via the extended PHD2 (ePHD2) domain of PHF6, and H2BK12 acetylation concomitantly stimulates H2BK120 mono-ubiquitination by the ePHD1 domain of PHF6 in vitro. Furthermore, the acetylation-dependent E3 ubiquitin ligase activity of PHF6 plays a key epigenetic regulatory function for expressions of trophectodermal genes. Together, my data provide evidence that H2BK12ac and H2K120ub linkage via PHF6 is crucial for trophectoderm differentiation through activating gene expression.

포유류의 초기 배아 발생 단계에서 세포 운명 결정을 위한 특정 유전자들의 발현 조절이 매우 중요하다. 이들 분화 유전자의 특이적 발현을 조절하는 데에 있어서 후성유전학적 조절이 중요한 역할을 한다. 그 중 배반포 분화는 태반 형성의 운명을 가지게 되는 세포들을 말하는데, Caudal Type Homeobox 2 (Cdx2)를 중심으로 배반포 분화로의 운명 결정에 관여하는 여러 중요한 전사 인자들은 밝혀졌지만, 이들의 발현을 조절하는 히스톤 변형에 대해서는 거의 밝혀진 바가 없다. Plant-Homeodomain Finger 6 (PHF6)는 PHD 도메인을 두 개 가지고 있는 유전자로, 이들 도메인을 통해 히스톤 변형을 인지하는 기능을 가질 것으로 추측하고 있다. PHF6는 백혈병과 Börjeson-Forssman-Lehmann (BFL) 증후군에서 가장 연구가 활발히 되었는데, 여러 유전학적 방법을 통한 연구를 통해 이 질병들에서 PHF6에 다양한 종류의 돌연변이 종류가 형성되었다는 것이 밝혀져 있다. 이 중 BFL 증후군 환자들은 초기 배아 단계의 발생 과정에서 여러 가지 문제가 생겼을 때 나타나는 전형적인 증상들을 보이고 있는데, 이를 통해서 PHF6가 초기 발생 단계에서 중요한 역할을 할 것이라고 추측할 수 있다. 그러나, PHF6의 정확한 분자적 기작에 대해서는 아직 밝혀진 바가 없다. 본 연구에서 PHF6가 결핍된 마우스 배아 줄기 세포를 만들었고, 이를 통해 초기 발생 및 분화 과정에서 PHF6가 배반포 초기 발생에 매우 중요한 역할을 한다는 것을 확인하였다. Phf6가 결핍된 배아 줄기 세포는 배반체로 분화하였을 때 배반포 세포들로 분화하는 세포들을 거의 형성하지 못하는 것을 확인하였다. 또한, 배아 줄기 세포를 배반포 세포로만 분화시켰을 때, 주요 전사 인자들이 Phf6 결핍 시에 발현하지 못하는 것을 전사체 분석을 통해 확인하였다. 이들의 전사 조절에 대한 PHF6의 분자적 역할을 분석해 본 결과, PHF6는 히스톤 H2BK12의 아세틸화를 인지하는 기능을 통해 전사 활성 마커인 히스톤 H2BK120 잔기를 유비퀴틴화 하는 리가아제 효소 활성을 지니고 있음을 확인할 수 있었다. 또한 배반포 분화 마커 유전자들의 프로모터 위에서의 H2BK120의 유비퀴틴화가 PHF6 의존적으로 증가하는 것을 확인함으로써, PHF6의 유비퀴틴화 효소 활성이 배반포 분화 마커 유전자들의 전사 조절에 중요하다는 것을 밝혔다. 본 연구에서는 아직 밝혀지지 않은 PHF6의 분자적 기작을 유비퀴틴화 리가아제 효소 활성을 가지고 있는 것으로 밝혀내었다. 히스톤 H2BK12 아세틸화의 경우 전사 활성에 관여하는 메커니즘이 밝혀진 바가 없었는데, 본 연구에서 PHF6를 통한 H2BK120 유비퀴틴화를 통해 H2BK12 아세틸화가 전사 활성에 기여한다는 사실을 밝혀내었다. H2BK120 유비퀴틴화는 히스톤 H3K4 삼중메틸화의 선행으로 작용한다는 사실이 잘 밝혀져 있고, 이러한 기존의 보고와 더불어 본 연구는 H2BK12 아세틸화 – H2BK120 유비퀴틴화 – H3K4 삼중메틸화로 이어지는 히스톤 변형 간의 상호 작용을 밝혀내었다. 또한, 초기 발생 중 배반포 분화에서는 히스톤 변형 조절을 통한 배반포 분화 마커 유전자들의 발현 조절 기작이 밝혀진 바가 거의 없었는데, 본 연구에서 새롭게 밝힌 히스톤 상호 작용이 배반포 발생에 중요한 역할을 한다는 것을 처음으로 밝혀내었다.